近年来, 恶性肿瘤发病率和死亡率不断升高。子宫颈癌、卵巢癌和子宫内膜癌已成为危害女性生命健康的常见肿瘤^[1]。子宫颈癌的早期预防、及时诊断和有效治疗尤为重要。微小RNA(microRNA, miRNA)是一类非编码单链小分子RNA, 长度约为20~22个核苷酸, 为目前新的研究热点^[2]。miRNA广泛存在于许多生物体中, 遍布于植物、动物乃至于病毒中^[3]。miRNA在多种肿瘤中发挥重要作用。上调乳腺癌MCF-7细胞的miR-27a-3p表达促进细胞增殖、侵袭和迁移^[4]。miRNA152通过作用于抑癌因子叉头状转录因子O1(fork head transcription factor O1, FOXO1), 使细胞周期调控失调和凋亡反应受损, 从而促进子宫内膜癌的发展^[5]。而miR-145在卵巢癌中呈低表达, 通过靶向作用于高迁移率蛋白A2(high-mobility group protein A2, HMGA2)而发挥作用, 进而抑制肿瘤细胞的生长和迁移, 并促进卵巢癌细胞的凋亡^[6]。本研究组前期已经证实miRNA27a在子宫颈癌组织中呈低表达。本研究着重于探讨miRNA27a对子宫颈癌细胞迁移和侵袭能力的影响。

1 材料与方法 1.1 细胞培养

分别取子宫颈癌HeLa细胞株和SiHa细胞株(中国科学院上海细胞库)置于含10%胎牛血清及青霉素、链霉素双抗溶液的DMEM培养液中, 并放于37℃、5% CO₂恒温培养箱中进行培养。观察细胞生长状态, 定期更换培养液, 待细胞处于对数生长期时进行传代及后续操作。

1.2 细胞转染

miRNA27a模拟物(miRNA27a mimic)序列:上游引物为5'-UUCACAGUGGCUAAGUUCCGC-3', 下游引物为5'-GGAACUUAGCCACUGUGAAUU-3'; miRNA27a模拟物无关序列(miRNA27a negative control, miRNA27a NC):上游引物为5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3', 下游引物为5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'。序列的设计和合成均来源于上海吉玛生物技术有限公司。子宫颈癌HeLa细胞和SiHa细胞分别分为3组:未转染组细胞常规培养, 定期换液; mimic-miRNA27a组转染miRNA27a模拟物, mimic-NC组细胞转染miRNA27a模拟物无关序列。操作步骤参照脂质体2000(Invitrogen公司, 美国)试剂说明书, 采用荧光定量聚合酶链反应(realtime polymerase chain reaction, RT-PCR)检测确定细胞成功转染。

1.3 RT-PCR

通过Trizol-离心柱法(Trizol试剂购于美国Invitrogen公司)提取出细胞总RNA, 借助于Merinton SMA4000紫外分光光度仪(Thermo公司, 美国)检测, 观察A_{260 nm}/A_{280 nm}比值, 计算目标RNA溶液浓度, 判断目标RNA提取质量。运用RNA反转录试剂盒(Roche公司, 瑞士)将RNA反转录为cDNA, miRNA27a PCR引物序列(上海生工生物工程有限公司):上游引物为5'-CGGCGGTTTCACAGTGGCTAAG-3', 下游引物为5'-CCAGTGCAGGGTCC GAGGTAT-3'。反应程序中, 扩增曲线:95℃ 5 min 1次; 95℃ 5 s, 60℃ 30 s共40次循环。熔解曲线:95℃ 15 s, 60℃ 30 s, 95℃ 15 s。

1.4 Transwell肿瘤细胞迁移实验

将transwell小室(孔径为8 μm; BD Biosciences公司, 美国)置入24孔板中, 聚碳酸脂膜(polycarbonate membrane, PC膜)上层为无血清培养液, 下室为含10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的培养液, 取1×10⁵个转染24 h的细胞重悬于上层无血清培养液中, 将细胞混合液贴壁放置于小室上层, 在37℃、5% CO₂条件下进行培养15 h, 将小室取出, 去除24孔板下室中的培养液, 棉签擦去transwell小室上层细胞, 用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline, PBS)冲洗3次, 于室温下用甲醇固定5 min, 用0.5%结晶紫进行5 min染色后, 用清水浸洗5~8次, 倒置晾干, 用刀片将PC膜取下, 封片, 于高倍镜下每孔随机选取3个视野拍照, 并对穿膜细胞进行计数。实验重复3次后, 进行统计分析。

1.5 Transwell肿瘤细胞侵袭实验

将transwell小室置入24孔板中, 在小室的聚碳酸脂膜上加入1 mg/mL Matrigel(MG)基质胶40 μL(MG/PC膜), 取2×10⁵个转染24 h的细胞重悬于上层无血清培养液中, 将细胞混合液加到基质胶上层, 将含20%FBS的培养液加到小室下层, 在37℃、5%CO₂条件下培养24 h后将小室取出, 去除24孔板下室中的培养液, 擦拭掉上层细胞并用PBS冲洗3次, 室温下用甲醇固定, 用结晶紫染色, 清水浸洗后晾干, 封片。于高倍镜下每孔随机选取3个视野拍照, 并对穿膜细胞进行计数。实验重复3次后, 进行统计分析。

1.6 Western blot实验

收集2×10⁵个呈对数生长期的细胞, 利用蛋白提取试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)分别提取各组细胞总蛋白, 用聚氰基丙烯酸正丁酯(butyleyanoacrylate, BCA)蛋白定量试剂盒(Thermo公司, 美国)检测蛋白浓度。提取总蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳分离, 进行电转将电泳产物转至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜上, 封闭5%脱脂牛奶1 h, 分别将1:1 000和1:2 000稀释的基质金属蛋白酶2 (matrix metalloproteinase 2, MMP-2)、MMP-9及对照蛋白特异性一抗(CST公司, 美国)加入, 于4℃下孵育过夜, 用Tris盐酸盐缓冲液(tris buffered saline tween, TBST)进行漂洗4次, 每次4 min, 将相应浓度二抗(CST公司, 美国)加入后, 于室温下静置1 h, 再用TBST漂洗4次, 每次4 min, 加入发光液(electrochemiluminescence, ECL; 上海天能科技有限公司)进行化学发光显影, 凝胶成像仪(上海天能科技有限公司)对蛋白条带进行观察, 获得图像, 并通过灰度分析(Image Lab软件), 记录灰度值, 计算目的蛋白与内参蛋白的灰度比值。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase, GAPDH)蛋白(Santa公司, 美国)作为内参照。实验重复3次后, 进行统计分析。

1.7 统计学分析

采用SPSS26.0统计软件作数据分析。计量资料采用均数±标准差($\bar x \pm s$)表示, 两组间比较采用完全随机设计资料的t检验, 多组间比较采用单因素方差分析, 组间两两比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 miRNA27a mimic转染效率的检测

子宫颈癌HeLa和SiHa细胞转染24 h后, RT-PCR结果均显示, mimic-miRNA27a组的miRNA27a相对表达量高于mimic-NC组和未转染组, 差异均具有统计学意义(均P < 0.05);而mimic-NC组和未转染组miRNA27a相对表达量比较, 差异均无统计学意义(均P>0.05, 图 1)。

2.2 上调miRNA27a影响子宫颈癌细胞的迁移能力

Transwell小室迁移实验检测子宫颈癌HeLa细胞和SiHa细胞迁移能力显示, 转染24 h后, mimic-miRNA27a组与mimic-NC组、未转染组比较, 2种细胞的穿膜细胞数均减少, 差异均具有统计学意义(均P < 0.05)。而mimic-NC组与未转染组比较, 差异均无统计学意义(均P>0.05, 图 2)。

2.3 上调miRNA27a影响子宫颈癌细胞的侵袭能力

Transwell小室侵袭实验显示, 在子宫颈癌HeLa细胞和SiHa细胞中, 转染24 h后, mimic-miRNA27a组与mimic-NC组、未转染组比较, 2种细胞的穿膜细胞数均减少, 差异均具有统计学意义(均P < 0.05, 图 2); mimic-NC组与未转染组比较, 差异均无统计学意义(均P>0.05)。

2.4 上调miRNA27a可影响MMP-2和MMP-9蛋白的表达

Western blot实验显示, 转染24 h后, 在HeLa细胞和SiHa细胞中, mimic-miRNA27a组与mimicNC组、未转染组比较, 2种细胞中MMP-2和MMP-9蛋白表达量均降低, 差异均具有统计学意义(均P < 0.05, 图 3); mimic-NC组与未转染组比较, 差异均无统计学意义(均P>0.05)。

3 讨论

子宫颈癌如果早发现并早治疗, 预后良好, 早期子宫颈癌的5年生存率达90%以上, 而中期和局部晚期子宫颈癌易出现复发转移, 治疗效果欠佳, 生存率低。肿瘤的转移是肿瘤细胞从原发肿瘤组织中分裂出来, 通过血液循环, 种植于远处, 并在新部位建立细胞血供, 逐步生长形成危及生命的肿块的过程, 多种生长因子及细胞因子都参与其中并发挥重要的作用^[7-8]。目前, 对miRNA27a在子宫颈癌的研究甚少, 其在子宫颈癌迁移和侵袭过程中的具体机制仍不明确。miRNA27a是miRNA家族的一个重要成员, 在肿瘤的发生和发展中起到重要的作用, 在对胃癌的研究中发现, 上调胃癌SGC-7901细胞中miRNA27a的表达, 凋亡相关蛋白BCL-2表达上调, p53水平下降, 与miRNA27a靶向抑制FOXO1基因表达有关^[9]。对于卵巢癌的预后而言, miRNA27a通过对P-gp在翻译水平的抑制, 提高卵巢癌细胞对顺铂的敏感性^[10]。本研究证实, 在子宫颈癌细胞的迁移和侵袭过程中miRNA27a发挥着极其重要的作用。本研究组前期研究证实, miRNA27a在子宫颈癌组织中呈低表达。本研究采用transwell细胞迁移和侵袭实验证实, miRNA27a对子宫颈癌细胞的迁移和侵袭能力有抑制作用。

MMP-9是基质金属蛋白酶家族中重要一员, 其与肿瘤的浸润和转移有关^[11]。MMP-9作为一种Ⅳ型的胶原蛋白, 主要作用是降解细胞外基质(extracellular matrix, ECM)。ECM是防止恶性肿瘤细胞侵袭和转移的重要生理屏障, 对防止肿瘤细胞的扩散有重要作用, 因此MMP-9在肿瘤的转移过程中有一定意义^[12-13]。MMP-2同样也是基质金属蛋白酶家族中的一员, 参与许多恶性肿瘤的侵袭迁移, 为治疗肿瘤的一个新的靶点^[14]。研究表明, 中医药黄芩苷可通过调节p38信号通路下调MMP-2和MMP-9的表达, 进而抑制子宫颈癌HeLa细胞侵袭和转移^[15]。

本研究显示, 上调miRNA27a后子宫颈癌细胞MMP-2和MMP-9的相对表达量减少, 表明miRNA27a对MMP-2和MMP-9的表达起抑制作用。后期本研究组将建立裸鼠子宫颈癌异种移植模型, 进一步探索上调miRNA27a对在体子宫颈癌细胞迁移和侵袭的影响及其相关的分子机制, 从而为子宫颈癌的靶向治疗提供科学依据。

综上所述, miRNA27a在子宫颈癌组织中呈低表达, 上调miRNA27a的表达抑制子宫颈癌细胞的迁移和侵袭能力。本研究对子宫颈癌的迁移和侵袭的机制研究提供新的思路, 为子宫颈癌在临床诊疗过程中提供理论基础及潜在的分子靶向位点。