依据美国国立卫生研究院(National Institutes of Health, NIH)工作组、生物标志物联合会和美国国家癌症研究所(National Cancer Institute, NCI)指南, 肿瘤标志物是指血液、其他体液或组织中发现的, 可作为肿瘤发生和发展过程标志的物质或结构^[1]。目前临床常用肿瘤标志物多为生化类指标, 如酶和糖蛋白等。随着基因组学和分子生物学等学科的发展, 肿瘤标志物的研究和应用也有新进展, 出现很多新型分子标志物, 如DNA突变、染色体异位缺失和表观遗传学异常等。DNA甲基化是表观遗传学的重要组成内容, 是指在DNA甲基转移酶的催化下, S-腺苷甲硫氨酸将甲基连到CpG岛(CpG island, CGI)胞嘧啶5位碳原子的过程。在肿瘤细胞中DNA整体呈低甲基化状态而某些特定区域如启动子区高甲基化状态^[2]。一般高甲基化意味着基因的沉默, 低甲基化意味着基因的活化。一些重要的基因如抑癌基因、DNA修复基因的启动子区域会发生高甲基化, 导致这些基因表达下调, 造成细胞的正常分化调控失常和DNA的损伤不能被修复, 最终肿瘤发生。

DNA甲基化异常改变是一种具有稳定性、可逆性和高频性的新型肿瘤标志物, 且较容易经无创性操作从体液中取得标本进行检测, 具有很大临床研究和转化潜力。一些研究成果已经进入临床应用, 对肿瘤临床诊断、指导用药、疗效评估和预后分析等发挥积极作用^[3]。本文对近年来DNA甲基化分子标志物的临床研究进展作一综述。

1 DNA甲基化标志物与肿瘤早期诊断

许多类型肿瘤早期治疗效果较好, 但由于其早期诊断率低, 多数患者就诊时已处于晚期, 影响治疗效果。DNA甲基化的异常改变早于肿瘤的形成和发展, 因此特定基因的异常甲基化可作为肿瘤早期诊断的标志物。在鼻咽癌研究中发现, RAS相关区域家族1A(Ras association domain family 1A, RASSF1A)基因和β-连环蛋白抑制基因2(disheveled-associated binding antagonist of β-catenin 2, DACT2)启动子甲基化可以作为早期辅助诊断的标志物^[4-5]。子宫颈癌的相关研究提示钙黏附蛋白11(cadherin 11, CDH11)和腺瘤性结肠息肉病(adenomatous polyposis coli, APC)基因甲基化可能是子宫颈癌独特的基因甲基化谱成员之一, 有望成为子宫颈癌早期诊断的新型标志物^[6-7]。在结直肠癌研究中, 一项涉及24篇文章和2 025例患者的meta分析报道, APC基因启动子高甲基化是结直肠癌发生的早期事件, 可以作为早期结直肠癌的诊断指标^[8]。淋巴造血系统肿瘤研究报道, 正性调控区域1(the positive regulatory domain 1, PRDM1)在弥漫大B细胞淋巴瘤发挥抑癌基因作用, 其亚型基因PRDM1α高甲基化沉默和PRDM1β低甲基化激活是弥漫大B细胞淋巴瘤中出现的高频事件, 提示PRDM1基因甲基化有望作为弥漫大B细胞淋巴瘤的一个候选分子诊断标志物^[9-10]。原钙黏蛋白10(protocadherin 10, PCDH10)基因启动子高甲基化在多种类型非霍奇金淋巴瘤发生早期属于高频事件, 这提示PCDH10基因甲基化具有早期辅助诊断非霍奇金淋巴瘤的作用^[11]。甲硫氨酸合成酶还原酶基因(methionine synthase reductase, MTRR)启动子甲基化状态对儿童急性淋巴细胞白血病的早期诊断、恶性程度评估、治疗、复发风险及预后评估具有重要作用^[12]。

特异基因甲基化标记组合相较于单一的基因甲基化标志物对肿瘤的早期诊断具有更高的敏感度。Yang等^[13]报道, RASSF1A、Wnt抑制因子1 (Wnt inhibitory factor 1, WIF1)、死亡相关蛋白激酶1(death associated protein kinase, DAPK1)和视黄酸受体β2(retinoic acid receptor β2 gene, RARβ2)基因组合甲基化检测联合EB(Epstein-Barr, EB)病毒检测较单独EB病毒检测可以提高鼻咽癌早期诊断率。Li等^[14]使用全基因组甲基化方法检测到鼻咽癌细胞株和病理样本中分泌型卷曲相关蛋白1(secreted frizzled-related protein 1, SFRP1)、SFRP2、SFRP5、DACT1、DACT2和Dickkopf相关蛋白3(Dickkopf-related protein 3, DKK3)基因均呈高甲基化水平, 提示其组合具有作为鼻咽癌诊断标志物的潜能。国外相关研究者评估子宫颈癌组织中12个基因:Rho GTP酶活化蛋白6 (Rho GTPase activating protein 6, ARHGAP6)、心脏神经脊衍生物表达转录因子2(heart and neural crest derivatives expressed transcript 2, HAND2)、LIM同源框基因9(LIM homeobox 9, LHX9)、Hes家族bHLH转录因子2(Hes related family bHLH transcription factor with YRPW motif 2, HEY2)、NK2同源框基因2(NK2 homeobox 2, NKX2-2)、PCDH10、垂体同型框2(paired like homeodomain 2, PITX2)、同源异型盒基因转录因子1(Prospero homeobox 1, PROX1)、T盒转录因子3(T-box transcription factor 3, TBX3)、核因子κB激酶抑制剂γ亚基基因(inhibitor of nuclear factor kappa B kinase subunit gamma, IKBKG)、RAB6C和DAPK1启动子甲基化, 发现上述基因启动子甲基化水平比较正常组织均较高, 提示这些基因启动子甲基化有望成为对子宫颈癌早期诊断有帮助的标志物^[15]。此外, 综合整理相关研究报道发现, 在子宫颈组织中检测到的100多个甲基化标记基因中, 有近20个基因在国内外许多研究中多次被探讨, 并且有大约10个基因在子宫颈癌和高度宫颈上皮内瘤样病变2(cervical intraepithelial neoplasia 2, CIN 2)和CIN3中被多次证实发生高甲基化, 例如细胞黏附分子1(cell adhesion molecule 1, CADM1)、红细胞膜蛋白配体4.1样3(erythrocyte membrane protein band 4.1 like 3, EPB41L3)、T淋巴细胞成熟相关蛋白基因(T lymphocyte maturation associated protein, MAL)、配对盒家族基因1(paired box 1, PAX1)和性别决定区域Y盒蛋白1基因(sex determining region Y box 1, SOX1)基因^[16]。研究人员以56例儿童淋巴瘤组织为试验组, 40例反应增生淋巴组织为对照组, 探讨7个具有抑癌特性基因[细胞周期依赖性激酶抑制基因(cyclin dependent kinase inhibitor 2A, CDKN2A)、丝氨酸蛋白酶抑制剂基因(serine protease inhibitor 1, SPI1)、过氧化物酶2(peroxiredoxin 2, PRDX2)、肺癌食管癌缺失基因1 (deleted in lung and oesophageal cancer 1, DLEC1)、叉头框转录因子O亚族1(forkhead box O1, FOXO1)、Kruppel样因子4(Kruppel like factor 4, KLF4)和DAPK1]的表达和甲基化状况^[17]。该研究发现, SPI1、PRDX2、DLEC1、KLF4和DAPK1基因在儿童淋巴瘤组织中出现高甲基化并导致基因沉默, 提示这些基因甲基化有望成为儿童淋巴瘤诊断的生物标志物, 并且将这些甲基化标志物进行有效组合, 可以提高早期诊断的敏感度和特异度。

相对于有创病理组织检查, 血液和尿液等体液或者粪便等排泄物中特定基因的异常甲基化状态, 也能为肿瘤的早期诊断提供方便快捷的支持。研究报道, 外周血中含SH2结构域磷酸酶1基因(the SH2 domain-containing phosphatase-1, SHP1)基因启动子甲基化检测在B细胞惰性淋巴瘤诊断中具有较好敏感度, 提示SHP1基因启动子区甲基化检测可以作为B细胞惰性淋巴瘤的早期辅助诊断指标^[18]。膀胱肿瘤患者尿液中巢蛋白2基因(nidogen 2, NID2)和同源盒A9基因(homeobox A9, HOXA9)甲基化检测敏感度均较好, 二者联合检测可以提高敏感度至89%, 这提示膀胱肿瘤患者尿液NID2和HOXA9甲基化联合检测可作为诊断原发性膀胱肿瘤的一种有效方法^[19]。结直肠癌患者血浆中胞裂蛋白9基因(Septin 9, SEPT9)启动子甲基化检测敏感度为72%, 特异度为90%, 有望为结直肠癌的诊断提供新的标准和思路^[20]。

2 DNA甲基化标记与疗效预测

药物治疗是肿瘤治疗的重要手段, 但由于药物疗效的局限性以及获得性耐药等限制最佳治疗方案的制定, 因此, 积极寻找特异性分子标志物来预测患者对特定药物的敏感性, 实现个体化治疗以达到最佳临床获益尤为重要。在结直肠癌相关研究报道, 半胱氨酸双加氧酶-1(cysteine dioxygenase type 1, CDO1)基因甲基化状态可能反映结肠癌术后辅助化疗的药物敏感性, 对于Ⅲ期结肠癌患者术后接受辅助化疗可能是一种有用的疗效预测标志物^[21]。Shiovitz等^[22]研究发现, 微卫星不稳定、CpG岛甲基化阳性Ⅲ期结肠癌患者应用伊立替康联合氟尿嘧啶/LV方案治疗可以延长总生存期(overall survival, OS)。此外, 相关报道称转录因子激活蛋白2E(transcription factor activator protein 2E, TFAP2E)高甲基化结直肠癌患者对氟尿嘧啶类化疗药物耐药性增加, 进一步研究发现, 这种TFAP2E甲基化依赖的耐药是由DKK4介导的, DKK4的靶向治疗可以有效减少耐药性增加, 提示TFAP2E甲基化检测可以帮助结直肠癌患者筛选最佳用药^[23]。在胃癌研究中, Li等^[24]进行DNA损伤修复基因:有丝分裂前期检查点基因(check point with FHA and ring finger, CHFR)、范可尼贫血相关基因F(FA complementation group F, FANCF)、O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(O6-methylguanine-DNA methyl transferase, MGMT)、MutL同源基因1(MutL homolog 1, MLH1)和RASSF1A甲基化作为胃癌化疗敏感指标的研究, 发现CHFR甲基化可能是多西他赛化疗敏感的标志物。在淋巴造血系统肿瘤研究中, Narayan等^[11]报道PCDH10基因启动子甲基化出现在多种类型非霍奇金淋巴瘤发生的早期, 甲基化会导致基因失活并造成对多柔比星耐药性增强。在淋巴母细胞白血病中, Narayan等^[25]发现启动子甲基化介导的PCDH10失活不单能造成对蒽环类药物耐药性增加, 还可以引起对硼替佐米的耐药性增加, 表明PCDH10基因启动子甲基化检测对多种化疗药物具有较好的疗效预测价值。

目前, DNA甲基化作为药物敏感性和疗效预测指标, 已经越来越多应用于临床研究和实践。洛莫司汀治疗伴有MGMT基因启动子甲基化的复发性胶质母细胞瘤的临床试验中, 甲基苄肼联合洛莫司汀治疗效果并不令人满意, 对于易复发和对替莫唑胺难治性的胶质母细胞瘤需要寻找新的治疗策略^[26]。塞来昔布治疗CDH13、组织因子途径抑制物2(tissue factor pathway inhibitor 2, TFPI2)和卵泡抑素样蛋白1(follistatin like 1, FSTL1)基因甲基化食管鳞状细胞癌研究显示, 塞来昔布的疗效与3个基因甲基化水平降低有关^[27]。Achille等^[28]针对hydroxyurea、阿扎胞甘联合吉妥单抗治疗老年急性髓系白血病的Ⅱ期SWOG S0703临床试验中, 治疗前和治疗过程中分别进行全基因组DNA甲基化检测、6个候选基因[CDKN2A、CDKN2B、高甲基化基因1(hypermethylated in cancer 1, HIC1)、视黄酸受体β(retinoic acid receptor β, RARB)、CDH1和凋亡蛋白酶活化因子1(apoptotic peptidase activating factor 1, APAF1)]的启动子甲基化检测和基因表达情况分析, 研究这些早期变化是否可以作为疗效预测指标。该研究显示:全基因组DNA甲基化状态和临床治疗反应无关; 在经3和4 d阿扎胞甘治疗后的患者中, 完全缓解(complete response, CR)的患者与未完全缓解的患者比较CDKN2A启动子甲基化降低; 在经过7 d治疗的患者中, 治疗有效的患者与无效的患者比较, RARB、CDKN2B和CDH1启动子甲基化降低, 提示外周血中特异性DNA甲基化分析可能有助于早期发现最可能受益于去甲基化药物治疗的老年急性髓系白血病患者。Gore等^[29]在地西他滨作为表观遗传诱导治疗急性髓细胞白血病的多中心随机研究中, 检测治疗第0和14天外周血和骨髓液中DNA甲基化状态, 发现外周血DNA甲基化检测较骨髓液DNA甲基化检测对于地西他滨治疗效果评估具有较好的敏感度和特异度。

3 DNA甲基化分子标记与肿瘤预后评估

目前肿瘤患者的预后评估多建立在临床病理分期和特定组织学特征上。然而, 相同分期的患者生存时间会存在异质性, 因此寻找新模型更准确判断患者预后有重要意义。利用特异性DNA甲基化发挥分子分型等作用来进行肿瘤预后评估具有巨大潜力。在乳腺癌研究中, 一项meta分析评估144个甲基化异常相关基因与乳腺癌预后的相关性, 证实甲基化直接相关的32个基因与乳腺癌患者预后相关^[30]。Ren等^[31]从基因组共享数据库中检索出1 076例乳腺癌患者包括DNA甲基化图谱在内等信息, 利用Horvath's法计算出DNA甲基化年龄, 采用Cox回归模型法研究乳腺癌组织DNA甲基化年龄和预后之间的关系, 发现乳腺癌组织中DNA甲基化年龄是乳腺癌预后评估的独立指标。在头颈部肿瘤研究中, Sailer等^[32]发现PITX2甲基化可作为头颈部鳞状细胞癌患者预后评估指标, 用来判断可能从强化监测和(或)佐剂管理、新佐剂治疗和免疫治疗获益的患者。Shen等^[33]筛选出口腔鳞状细胞癌差异甲基化位点, 分析甲基化对于口腔鳞状细胞癌预后评估作用, 证明DNA甲基化分析在口腔鳞状细胞癌患者的预后评估中发挥重要作用。5-羟甲基胞嘧啶的丢失是一种改变DNA甲基化模式的致癌事件, 也是肾癌不良预后的指标^[34]。Sobieszkoda等^[35]研究发现, MGMT启动子甲基化对老年急性白血病患者病情发展具有重要影响。

在胃肠道相关肿瘤研究中也发现多种在预后评估起重要作用的DNA甲基化相关肿瘤标志物。孕酮和脂联素受体3(progestin and adipoQ receptor family member 3, PAQR3)基因启动子高甲基化状态有望成为胃癌预后评估的分子标志物^[36]。Yamamura等^[37]发现长散在重复序列1 (long interspersed nuclear elements-1, LINE1)基因甲基化水平对胰腺癌患者生存可能存在影响, 但具体还需更大规模的研究来探讨。转染重编程基因(rearranged during transfection, RET)启动子甲基化与Ⅱ期结直肠癌患者预后较差相关, TFAP2E高甲基化提示预后良好, 并可以作为手术切除患者独立预后指标^[38-39]。Samadder等^[40]发现根据微卫星不稳定程度、CpG岛甲基化程度及有无鼠类肉瘤病毒癌基因(Kirsten rat sarcoma viral oncogene, K-RAS)或V-raf鼠肉瘤病毒癌基因同源B(V-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B, BRAF)基因突变情况将结直肠癌患者分为经典型、锯齿状型和未分类型, 其中未分类型患者较其他2种类型患者预后更差。另外, CDO1基因甲基化是影响Ⅲ期结肠癌预后的独立因素, CDO1高甲基化患者较CDO1低甲基化者化疗预后更好^[21]。

4 结语

大量研究证实, 异常DNA甲基化贯穿于肿瘤发生和发展的全过程, 在肿瘤形成早期、疾病进展期和晚期复发转移过程中均可以检测到异常甲基化改变^[41-42]。异常DNA甲基化可以作为预后评估和化疗敏感的标志物, 还可以作为表观遗传治疗的靶点。所以DNA甲基化被认为是一种很有前景的具有早期诊断、疗效预测、预后评估和指导个体化治疗等功能的肿瘤标志物(表 1)。此外, DNA甲基化分子标志物的检测标本来源可以为血浆/血清、粪便和尿液等, 这些标本可以通过无创性操作取得, 这可以增加其在临床应用中患者的依存性。相信随着相关前瞻性队列研究和随机临床试验的大规模开展, 有望将DNA甲基化分子标记转化为临床普遍接受应用, 使其在临床肿瘤诊疗中发挥更大作用^[43]。