肿瘤免疫治疗是目前肿瘤领域的研究热点，代表性的药物即为程序性死亡受体1(programmed death 1，PD-1)/程序性死亡配体1(programmed death ligand 1，PD-L1)抑制剂。目前PD-1/PD-L1抑制剂已经在美国食品和药物管理局(Food and Drug Administration，FDA)获批多个适应证，包括恶性黑色素瘤、转移性非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)、肾细胞癌、经典型霍奇金淋巴瘤、尿路上皮癌、转移性头颈部鳞状细胞癌、默克尔细胞癌、结直肠癌、肝细胞癌以及胃癌等。肿瘤免疫治疗已成为继手术、化疗、放疗和靶向治疗后肿瘤治疗领域的又一重要手段。但PD-1/PD-L1抑制剂在临床实践中却面临很多问题，如治疗周期长、费用高和一般有效率不高等。因此，在使用免疫调控点抑制剂时筛选优势人群就显得尤为重要。目前已经发现多种标志物可预测PD-1/PD-L1抑制剂的疗效，如PD-L1的表达水平、肿瘤突变负荷(tumor mutational burden，TMB)、微卫星高度不稳定(microsatellite instability-high，MSI-H)和错配基因修复缺失(mismatch-repair deficiency，MMR)等，而对于PD-L1的检测则研究的最早，最充分，故本文对PD-L1的检测问题进行综述。

1 PD-L1表达与检测方法

PD-1是属于CD28免疫球蛋白超家族的Ⅰ型跨膜糖蛋白，是一种负性共刺激分子。PD-1通常以单体的形式表达于激活的CD4⁺/CD8⁺T细胞、B细胞、自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)、单核细胞和树突状细胞表面。PD-1有2个配体：PD-L1和PD-L2，而PD-L1(B7-H1)是PD-1最主要的配体，属于B7超家族^[1-2]。在许多肿瘤环境中，肿瘤细胞高表达PD-L1分子，与肿瘤部位浸润T淋巴细胞表面的PD-1分子结合后，抑制T细胞活性，实现肿瘤的免疫逃避^[3-4]。

PD-L1表达的检测对PD-1/PD-L1抑制剂的应用有重要价值。PD-L1的检测是基于细胞蛋白水平的检测，因此临床试验中以免疫组织化学(immunohistochemistry，IHC)方法为主。免疫组织化学是检测蛋白表达的经典手法，通过抗体着色后由病理医师镜下观察着色深浅和阳性细胞比例。目前在NSCLC治疗中，对于每个PD-1/PD-L1抑制剂开发特异性PD-L1免疫组织化学检测方法，以评估NSCLC中恶性肿瘤和(或)免疫细胞上的PD-L1表达水平(表 1)。

2 PD-L1检测的临床意义

早期研究显示，PD-L1的表达与PD-1/PD-L1抑制剂的疗效相关。KEYNOTE-001的Ⅰ期研究结果发现^[5]，PD-L1高表达的NSCLC患者从pembrolizumab中获益最大，特别是PD-L1肿瘤细胞阳性比例分数(tumor proportion score，TPS) ≥50%的患者客观缓解率(objective response rate，ORR)为51.9%，12个月无进展生存(progression-free survival，PFS)率为54%，12个月总体生存(overall survival，OS)率为85%，较整体水平(分别为26.7%、35%和71%)提高。晚期NSCLC患者PD-L1的表达水平与患者使用nivolumab的疗效也存在关联。在CheckMate 063研究中，5%作为PD-L1表达的cut-off值，相关结果显示PD-L1表达≥5%的患者疗效优于PD-L1表达 < 5%的患者^[6]。CheckMate 057研究是一项随机开放的国际Ⅲ期临床试验，主要针对非鳞NSCLC患者正在使用或已使用含铂两药方案化疗分别予以nivolumab和多西他赛单药治疗，数据显示nivolumab治疗组优于多西他赛治疗组的OS获益几乎全部都由PD-L1表达＞10%患者所贡献^[7]。Nivolumab联合ipilimumab用于晚期NSCLC的研究中也证实，PD-L1≥1%的患者有效率更高，PD-L1≥50%的患者的有效率高达90%以上^[8]。POPLAR研究和OAK研究也显示，晚期NSCLC患者PD-L1的表达水平与患者使用atezolizumab的疗效存在关联，高表达的患者OS优于低表达的患者^[9-10]。KEYNOTE-010和KEYNOTE-024研究结果也表明，PD-L1表达对pembrolizumab的疗效至关重要^[11-12]。KEYNOTE-024研究是一项随机开放的国际Ⅲ期临床试验，旨在评价pembrolizumab较标准的含铂化疗应用于无表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)及间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase，ALK)驱动基因突变但高表达PD-L1(≥50%)的晚期NSCLC初治患者的有效性及安全性^[11]。研究发现，pembrolizumab组和化疗组的中位PFS分别为10.3个月和6.0个月，6个月OS率分别为80.2%和72.4%，有效率分别为44.8%和27.8%，治疗相关3~5级不良反应发生率分别为26.6%和53.3%，表明晚期无EGFR及ALK驱动基因突变的NSCLC患者(PD-L1表达≥50%)一线使用pembrolizumab，在有效性和安全性上都优于使用以铂类为基础的化疗方案。基于KEYNOTE-024研究结果，2016年10月24日FDA批准对于PD-L1高表达(≥50%)且无明确驱动基因突变的初诊的晚期NSCLC患者可以一线选择pembrolizumab，提示PD-L1的检测可以作为免疫调控点抑制剂的潜在获益人群筛查。此外，相关临床试验的研究显示，在其他肿瘤中，如转移性头颈部鳞癌^[13]、尿路上皮癌^[14-15]和恶性黑色素瘤^[16-18]，PD-L1的表达水平与患者使用免疫调控点抑制剂的疗效也存在关联。

3 PD-L1检测的现状与问题 3.1 PD-L1检测试剂和平台

PD-L1表达检测目前主要是2家公司的4种检测技术：美国安捷伦公司(Agilent)的Dako PD-L1 IHC 28-8 pharmDx和Dako PD-L1 IHC 22C3 pharmDx；瑞士罗氏公司(Roche)的VENTANA PD-L1(SP142) Assay和VENTANA PD-L1(SP263) Assay。

PD-L1 IHC 28-8 pharmDx应用兔单抗28-8和EnVision FLEX可视系统，在Autostainer Link 48染色平台上检测NSCLC(鳞癌除外)和黑色素瘤石蜡切片中PD-L1的表达，从而指导临床用药。PD-L1蛋白表达的定义是肿瘤细胞所呈现的任何强度的细胞膜阳性的百分率，细胞质染色(如果存在)不参与评分。

PD-L1 IHC 22C3 pharmDx应用小鼠单抗22C3和EnVision FLEX可视系统，在Autostainer Link 48染色平台上检测NSCLC石蜡切片中PD-L1的表达，从而指导临床用药。PD-L1蛋白应用TPS来定义，即呈现部分或完整细胞膜染色的可视肿瘤细胞的百分率。

VENTANA PD-L1(SP142) Assay应用兔单抗SP142和OptiView DAB IHC检测试剂盒，在VENTANA BenchMark ULTRA染色平台对尿路上皮癌的石蜡切片进行PD-L1表达的分析。PD-L1表达定义为任何强度PD-L1的浸润免疫细胞(immune cell，IC)所占据的肿瘤细胞面积的百分比，肿瘤细胞上的PD-L1表达不参与评分。但是在NSCLC中，除了继续沿用针对IC表达进行评判之外，也加入对于肿瘤细胞(tumor cell，TC)的评判，是唯一1个对肿瘤细胞和浸润的淋巴细胞均加以考虑的检测试剂，评估基于PD-L1任何强度表达的肿瘤浸润性免疫细胞占肿瘤面积的比例(%IC)或PD-L1任何强度表达在肿瘤细胞中的比例(%TC)。VENTANA PD-L1(SP142)检测测定的NSCLC组织中≥50%TC或≥10%IC有PD-L1表达可能与atezolizumab提高OS相关。

VENTANA PD-L1(SP263)Assay应用兔单抗SP263和OptiView DAB IHC检测试剂盒，运用VENTANA BenchMark ULTRA染色平台检测PD-L1在尿路上皮癌的肿瘤或免疫细胞膜中的表达。PD-L1表达定义为有任何强度细胞膜染色的肿瘤细胞在所有肿瘤细胞中所占百分比，或有任何强度PD-L1染色IC占总IC的百分比。VENTANA PD-L1(SP263)检测测定的PD-L1高表达与durvalumab提高ORR有关。2017年5月5日VENTANA PD-L1(SP263)检测获得CE(Conformite Europeenne，CE)认证，作为选择pembrolizumab治疗的体外诊断检测，检测NSCLC肿瘤细胞膜中PD-L1的表达水平有助于识别适用pembrolizumab治疗的患者。通过VENTANA PD-L1(SP263)检测出NSCLC肿瘤细胞膜中PD-L1的表达水平可能与nivolumab治疗后生存期延长有关。

3.2 PD-L1检测存在的问题

目前PD-L1检测仍然存在一些问题：(1)检测技术方面，如不同的检测抗体、平台以及不同阈值的问题；(2)生物学方面，如肿瘤内和肿瘤间异质性；(3)组织来源方面，如细胞学标本、存档标本与新鲜标本和原发部位与转移灶等。

3.2.1 检测技术方面

目前PD-1/PD-L1抑制剂都有对应的PD-L1检测方法，但是每种检测所用到的抗体和技术都不同，导致PD-L1表达水平的设定不同，同时对于不同的瘤种PD-L1表达水平的设定也不同(表 2)。国际肺癌研究协会(International Association for the Study of Lung Cancer，IASLC)在内的多个国际组织都在努力推进不同PD-L1表达检测技术分析，以期能够提供不同检测间可靠的对比数据。在Blueprint研究中，39份NSCLC的蜡块样本的系列切片采用各自药物临床试验所用的检测方法来分析PD-L1表达水平，由3名病理学家阅读和解释对肿瘤细胞和免疫细胞的检测结果^[19]。结果显示，3种抗体(28-8、22C3和SP263)的IHC分析在肿瘤细胞中具有很好的一致性，而SP142抗体染色肿瘤细胞相对较少。4种抗体对免疫细胞都有不同程度的染色，但一致性较差。Blueprint 2研究旨在用现实世界实践中的临床肺癌样本，分析5种抗体(28-8、22C3、SP142、SP263和73-10)的染色可比性^[20]。结果显示，28-8、22C3和SP263检测肿瘤细胞具有染色一致性，SP142检出阳性细胞较少，而73-10检出更多的阳性细胞。镜下阅片和远程数字化图像阅片结果具有较好的一致性。肿瘤组织中肿瘤细胞的染色评分的Kappa系数多数>0.8，具有高可靠性。而对免疫细胞的染色具有挑战性，一致性差而不可靠。对于细胞学样本，PD-L1染色的可靠性需要进一步确认。法国一项研究分析41例切除的NSCLC标本，评估4种抗体(28-8、22C3、SP142和SP263)的可比性，结果显示，28-8、22C3和SP263与肿瘤细胞染色高度一致^[21]。德国一项试验中，由9名病理学家使用6级评分(< 1%、≥1%、≥5%、≥10%、≥25%和≥50%)或4级评分(≥1%、≥5%、≥10%和≥50%)评估肿瘤细胞中检测的PD-L1表达，PD-L1表达水平28-8和22C3相似；SP142较28-8、22C3和SP263低，SP263较28-8、22C3和SP142高；使用完整的4级评分PD-L1表达水平(k为0.59~0.80，平均0.72)具有良好的一致性^[22]。Rimm等^[23]分析PD-L1 IHC检测方法(28-8、22C3和SP142)和实验室开发的检测方法(LDA和E1L3N)表明，SP142检测的肿瘤和免疫细胞PD-L1水平低于其他检测方法。检测方法的整体一致性良好(k=0.813)，如果SP142被排除则更高(k=0.971)。

3.2.2 生物学方面

Rehman等^[24]使用SP142评估从35例切除的NSCLC肿瘤样本中获得的3个单独的组织块上的PD-L1表达，通过肿瘤细胞染色分析，每个肿瘤的所有3个组织块的PD-L1水平相似。然而，当评估免疫细胞时，组织块之间的相关性仅为75%。Ilie等^[25]利用SP142评估160例NSCLC患者的手术切除标本和肺组织活检标本的PD-L1染色。PD-L1染色存在明显差异，118个手术切除标本(74%)被认为阳性[TC1/2/3和(或)IC1/2/3]，其中TC3或IC3占38%，而41个活检标本(26%)被认为阳性[TC1/2/3和(或)IC1/2/3]，其中TC3或IC3占18%。ATLANTIC试验(全球研究评估MEDI4736在局部晚期或转移性NSCLC患者疗效的临床试验)评估肿瘤间异质性，原发性和转移性样本之间的PD-L1肿瘤细胞染色(35%和33%)一致性为89%^[26]。Sakakibara等^[27]评估超声支气管镜(endobroncheal ultrasonography，EBUS)活检标本、切除的转移性淋巴结标本和切除的原发性肿瘤标本间肿瘤细胞中PD-L1的表达，显示出较好的一致性，但是这项研究受到小规模的限制，需要通过更多的样本研究来确认。3.2.3待测样本类别Skov等^[28]使用28-8和22C3检测方法比较86例配对的肺癌细胞学石蜡标本和组织学标本PD-L1表达水平，观察两者之间的一致性。提示当组织学标本不可用时，通过处理细胞学材料对肿瘤细胞的PD-L1表达进行检测是一种可接受的替代方法。PD-L1表达具有动态变化的特点，随时间和治疗应答而波动、上调或下调，并且关于存档标本与新鲜标本的价值也是争论的焦点。但是NSCLC相关研究经验表明，无论是新鲜标本还是石蜡标本，PD-L1检测都具有临床价值。KEYNOTE-001用的是新鲜手术标本，CheckMate-057用的几乎都是库存的标本，但2个研究中PD-L1对疗效的预测作用相似^{[5, 29]}。KEYNOTE-010研究中标本接近一半新鲜标本一半存档标本，两者PD-L1预测作用近似^[30]。2016年ESMO报告迄今最大样本量的NSCLC PD-L1检测数据，包括4 784例NSCLC，研究得出4项结论：鳞癌和腺癌的表达分布相似；经治和初治人群的表达分布相似；原发部位和转移灶的表达分布相似；新鲜标本和存档标本的表达分布相似。

4 结语

免疫治疗的2.0时代，如何使免疫治疗药物在肿瘤治疗中更加精准仍然是研究的主旋律，PD-L1检测方法的优化仅是一个部分。PD-L1作为标志物分析有效性最终是需要获得临床药物疗效的验证。同时，研究者还应充分认识到，药物敏感性预测标志物需要在PD-L1之外进一步探索，肿瘤浸润性免疫细胞、TMB、dMMR/MSI-H和基因特征等都是筛选患者的指标。目前PD-L1检测、TMB检测以及dMMR/MSI-H检测均已经应用于临床指导免疫检查点抑制剂的使用，但是三者之间有何联系目前尚不明确。在临床实践中如何选择对PD-1/PD-L1抑制剂治疗最有效的患者群体仍有待探索。