目前用于中枢神经系统(central nervous system，CNS)肿瘤的诊断和监测的标准临床手段具有一定的局限性。虽然组织活检提供组织学和遗传学信息，但获得中枢神经系统组织具有侵入性，风险极大，而且不利于长期反复取样。最常见的非侵入性手段是神经系统影像学检查，MRI检查可以缓慢显示肿瘤进展，但是治疗相关的MRI变化还有可能为假性进展^[1]。液体活检作为体外诊断的一个分支，是指通过检验血液或者其他体液如尿液、唾液、胸腔积液和脑脊液(cerebrospinal fluid，CSF)等，对肿瘤等疾病作出诊断。包括循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)、循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)、微小RNA和微泡(外泌体)、甚至血小板等多项技术^[1-2]，是对生物体液中的肿瘤细胞或核苷酸的实时取样，为监测中枢神经系统恶性肿瘤提供一种具有前景且侵袭性较小的手段。而且CSF循环于脑室和脊髓池，与中枢神经系统直接接触，含有大量的中枢神经系统代谢物质，因此成为检测中枢神经系统肿瘤的理想样本^[3]。本文就液体活检在原发性和继发性中枢神经系统恶性肿瘤中的作用进行综述，并探讨其应用的主要限制因素。

1 CTCs和ctDNA 1.1 CTCs概念

CTCs是从肿瘤原发部位或转移部位脱落的细胞，随后迁移到血液循环或其他体液中。CTCs已经被证实在肿瘤转移的发生和发展中起至关重要的作用，但CTCs从肿瘤原发灶中脱落、进入血液循环和侵入靶器官以用于转移的定植过程非常复杂^[2]。阐明这些机制对指导早期治疗、检测耐药甚至预防转移有重要意义。虽然对CTCs侵袭性的倾向和表型了解尚不完全，但目前已有大量研究证实CTCs在恶性实体肿瘤诊断、治疗和预后中的临床重要性^[2]。

1.2 细胞游离DNA(cell-free DNA，cfDNA)及ctDNA概念

cfDNA是细胞在溶解或凋亡过程中释放到血液循环或其他体液(包括CSF)中的单链或双链DNA片段。1977年，在肿瘤患者血清中首次发现cfDNA，但直到1994年才发现部分循环DNA片段存在与肿瘤相同的突变，这一发现证实部分cfDNA是由肿瘤来源的DNA组成的^[4]。这种完全来源于肿瘤细胞的cfDNA称为ctDNA，是从原发或转移的坏死、凋亡或快速增殖的细胞以及CTCs中脱落的DNA片段^[5]。

ctDNA的发现提供一种发现肿瘤的非侵袭性手段，并且能够识别可接受靶向治疗的肿瘤突变类型以及明确耐药的特殊机制。ctDNA检测的一个挑战是血清中ctDNA的相对稀缺性，血清ctDNA在cfDNA中的比例为1%~10%，取决于疾病分期和肿瘤负荷^[6]。因此，现有的ctDNA检测方法在筛选出非肿瘤源性循环DNA的同时，必须具有足够的敏感度和特异度，才能准确地提取肿瘤DNA。由于CFS中非肿瘤源性DNA水平较低，所以ctDNA与cfDNA的比值远高于血清，更容易检测出低频突变，准确率更高^[7-8]。随着ctDNA检测方法的发展，研究人员能够确定ctDNA在恶性肿瘤诊断、预后及明确靶向治疗中的耐药突变有着重要的作用^[9]。

2 CSF中CTCs和ctDNA在中枢系统肿瘤中的应用 2.1 CSF中CTCs和ctDNA用于中枢系统肿瘤的诊断 2.1.1 CSF中CTCs的诊断意义

CTCs在CSF中对原发性和转移性CNS疾病的治疗意义尚不清楚。到目前为止，CSF中CTCs的检测主要是对实体肿瘤脑膜转移(leptomeningeal metastasis，LM)的辅助诊断^[10]。Nayak等^[11]首次证明，与传统的影像学和CSF细胞学方法比较，CSF CTCs诊断LM的敏感度和特异度有所提高。CSF CTCs阳性诊断的敏感度为100%，特异度为97.2%，优于传统LM的诊断方法。与之比较，腰椎穿刺细胞学诊断的敏感度为66.7%，MRI表现的敏感度为73.3%，影像学与细胞学相结合的敏感度为86.6%。研究也证实，CSF CTCs检测诊断的敏感度和特异度高于标准方法，而假阳性的发生可能与脑室周围巨大肿瘤的解剖位置相关，导致CTCs释放入CSF^[12-13]。

2.1.2 CSF中ctDNA的诊断意义

如何确定最佳标本的生物流体来评价ctDNA在中枢神经系统肿瘤中作用是难点之一。一些中枢神经系统肿瘤检测血液ctDNA的研究取得成功^[14-15]。但是也有其他研究发现，血液ctDNA在中枢神经系统肿瘤患者中相对不敏感^[9]。其中一项研究评估640例不同类型肿瘤患者血浆ctDNA(包括41例原发性脑肿瘤)发现，多数非中枢神经系统恶性肿瘤患者中检测出血浆ctDNA，而中枢系统肿瘤患者血浆ctDNA检出则较低^[9]。原发性中枢神经系统肿瘤血浆ctDNA敏感度低的原因可能是血-脑脊液屏障的存在阻止ctDNA进入外周血液循环中，这意味着抽取CSF可能是一个潜在检测ctDNA的方式。

研究发现，胶质母细胞瘤、髓母细胞瘤以及脑转移等中枢神经系统肿瘤患者的CSF中均可检测到ctDNA，但并非所有患者外周血中都携带ctDNA，CSF ctDNA水平高于外周血^[15-16]。这说明中枢神经系统恶性肿瘤患者CSF ctDNA较血清丰富，也可作为诊断脑膜转移的辅助工具。研究发现，原发高级别脑胶质瘤CFS与血浆中ctDNA启动子甲基化水平相当^[17]。对28例中国表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)敏感突变的非小细胞肺癌同时伴有脑膜转移的患者进行CSF全基因组ctDNA检测，与血浆ctDNA及CSF沉渣比较，EGFR突变率的一致性为100%，但是CSF ctDNA携带不同于血浆及CSF沉渣的突变，丰度更高且基因谱更广^[18]。研究表明，ctDNA在中枢神经系统肿瘤患者中的诊断率可能高于外周血。

CSF ctDNA的检测有望成为脑实质肿瘤及脑膜转移的诊断工具，以避免高风险的活检。约80%的原发脑肿瘤可检测到CSF ctDNA，而且其中约50%的肿瘤位置靠近脑干的患者CSF检测到ctDNA的全部外显子信息^[8]。所以CSF ctDNA可以代替手术高危患者的组织活检，其在脑室周围肿瘤患者中的检出率最高。除多数原发脑肿瘤可以检出CFS ctDNA外，脑转移同样可以在CSF中检测到^[7]。CFS ctDNA可作为评价LM的辅助工具，在一些小样本的研究中，ctDNA比CFS细胞学更敏感^[15]。

2.2 CSF中CTCs和ctDNA用于中枢系统肿瘤的治疗 2.2.1 CSF中CTCs的治疗意义

目前中枢神经系统肿瘤的治疗中CSF CTCs动态变化的研究还较为罕见。但是早期数据显示，CSF中CTCs负荷与血液相似，与治疗反应及临床症状的严重程度相关^{[12, 19-20]}。对5例有实质性或CNS软脑膜转移的乳腺癌患者进行CSF CTCs检测的小样本研究发现，CSF CTCs>10⁴的患者伴有严重的中枢神经系统不适反应，鞘内治疗后，受试者CSF CTCs计数明显下降，同时体力状态评分(Karnofsky performance status，KPS)得到相应改善^[20]。对7例乳腺癌LM患者进行连续CSF分析的另一项研究发现，所有患者在鞘内治疗或脊髓照射后CSF CTCs均有减少^[12]。治疗后CSF CTCs完全清除的患者比检测到残留CTCs的患者生存时间更长。部分人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor-2，HER2)阳性乳腺癌LM患者在临床进展前CSF CTCs数量可持续增加1个月^[21]。此外，用于靶向治疗和耐药性监测的CSF CTCs的基因谱和分子特征仍在研究中。部分CTCs具有循环肿瘤干细胞(circulating tumor stem cells，CTSCs)的特性，CTSCs与肿瘤发生、复发及转移直接相关。具有这种特性的CTCs可被认为是CTSCs^[22]。这种特殊的CTCs被认为是复发的干祖细胞，是转移发生的直接贡献者^[23]。由于CTCs与肿瘤预后的相关性已经得到大量证实，所以这些特殊类型的CTCs与CTSCs的关系，尤其对于肿瘤的早期诊断意义及对健康人的筛查更值得持续关注。

2.2.2 CSF中ctDNA的治疗意义

近年来，ctDNA作为治疗反应的标志物也得到应用。有研究对原发性或转移性脑肿瘤患者不同时间点CSF ctDNA进行检测，同时进行颅脑影像学的检查^[15]。CSF ctDNA水平在术后和全身治疗有效影像学缓解时减少，随着治疗进展ctDNA水平下降后上升。对接受手术的EGFR突变型胶质母细胞瘤进行ctDNA检测，全切除血清ctDNA EGFR消失，而次全切除仍可检测到ctDNA EGFR^[14]。其他研究也报道中枢神经系统肿瘤CSF ctDNA水平与治疗反应的一致性^[24]。CSF ctDNA可用于评估中枢神经系统肿瘤临床相关基因组改变，ctDNA可显示临床上重要的突变，有助于指导治疗决策，并显示早期耐药机制^[7]。目前基于ctDNA都是一些小样本的研究，仍然需要对这部分患者ctDNA的检测作进一步的探索。

ctDNA也被研究者作为调整治疗方案的工具。在一项研究中，对20例伴有脑转移的非小细胞肺癌患者组织及CFS进行EGFR的突变检测^[19]，其中2例患者CFS检测到EGFR突变，而组织阴性，这表明CSF可携带不同于组织的突变，在EGFR酪氨酸激酶抑制剂的治疗后也取得临床缓解。在另一项评估CNS肿瘤的研究中，CNS转移的患者基于既往组织基因突变的结果，进行靶向治疗，部分患者接受治疗的同时出现CNS疾病的进展^[7]，在这部分患者中，4例CSF中发现治疗开始时未出现在组织中的耐药突变。目前的证据表明，ctDNA可用于实时识别具有重要意义的靶向突变，在转移性疾病中，这种突变可能是中枢神经系统特有的。

虽然人类基因组包含人体的全部遗传信息，但蛋白质是完成生命活动的终极执行者，也是机体各种细胞之间差异的决定因素。不同细胞活跃基因不同，合成的蛋白质也不同，这也包括肿瘤细胞。蛋白质组学作为生物过程的功能实体，表达水平直接和疾病过程和病理学相关，成为生物标志物和治疗的靶标。目前的蛋白质组学技术在单一反应中分析组织或生物液体的整个蛋白质组的能力受到限制。目前，已在多种肿瘤如肺癌、胃癌和胰腺癌中找到有差异表达的蛋白质，有望成为有效的肿瘤标志物。

血清细胞骨架相关蛋白4(cytoskeleton-associated protein 4，CKAP4)水平可区分肺癌患者和健康对照者；Ⅰ期腺癌或鳞状细胞癌患者血清CKAP4水平高于健康对照组(P＜0.01)，而在Ⅰ期非小细胞肺癌中也检测到CKAP4水平的升高^[25]。胰岛素样生长因子结合蛋白(insulin-like growth factor-binding protein，IGFBP)2和IGFBP3蛋白在早期胰腺癌患者体内存在变化^[26]。研究显示，血清蛋白质的不同表达与胃癌的分子分型相关，而且这种分子分型与生存预后和化疗敏感度密切相关，13%(25/183)的基因虽然检测到突变，却未检测到对应的蛋白表达；其中，患者有KRAS和NRAS激活突变，癌旁组织也发现蛋白表达，但在癌组织中却检测不到KRAS或NRAS蛋白。如果基于RAS基因测序指导精准医疗，对于不存在治疗蛋白靶点的肿瘤患者，很可能无法受益^[27]。

然而，与血清不同的是，CSF是一种代谢活性的培养液，含有远少于血清的复杂的蛋白质补体^[28]。这一特性可以使肿瘤特异度标志物更清楚地被测量，更容易被发现，而成为潜在生物标志物的良好来源。CSF蛋白组学分析已应用于发现中枢神经系统原发恶性肿瘤及转移瘤，如软脑膜转移、中枢神经系统淋巴瘤和胶质瘤^[29]。在CNS淋巴瘤中，这些研究首次揭示蛋白质组分析在生物标志物识别中的应用价值，表明与标准的CSF细胞学方法比较，识别特定的蛋白质对检测转移瘤有更大的敏感度^[30]。对原发性神经恶性肿瘤CSF的蛋白质组学检测在脑膜瘤和星形细胞脑肿瘤也取得一定的成功。CSF中蛋白质含量与疾病发展相关。CSF中蛋白标志物可用于监测治疗的疗效和疾病的复发。

3 结语

CSF存在于脑室及蛛网膜下腔，包围并支持着整个脑及脊髓，由于其独特的解剖位置及血-脑脊液屏障，使得CSF中CTCs及ctDNA的存在对中枢神经系统肿瘤的诊断具有更高的敏感度和特异度。与血清比较，CSF ctDNA更能反映颅内的基因谱，不易受背景DNA的干扰，在颅内肿瘤的诊断和治疗中更具优势。血浆CTCs单细胞全基因组测序与组织一致性接近90%，血浆ctDNA可检测出不同来源的特征性突变，可以确定不明原发部位肿瘤(carcinoma of unknown primary，CUP)^[31]。这提示CSF CTCs单细胞测序及ctDNA的检测能够寻找肿瘤脑转移的原发部位。CSF中CTCs与ctDNA的含量较血浆丰富，且携带不同于组织与血浆的基因突变，所以对CSF反复取样能够及早发现耐药基因突变，调整治疗方案。

蛋白质具有行使功能，蛋白质组学的分析对肿瘤治疗更具指导意义。CSF中的特殊蛋白质可用于中枢神经系统肿瘤的诊断，而且CSF中蛋白质含量与疾病发展相关，可监测治疗的疗效和疾病的复发。

综上所述，CSF与血清比较，受背景标志物干扰更小，所以CSF中CTCs、ctDNA及蛋白质的检测在中枢系统肿瘤的诊断、治疗和预后更具优势。在颅内肿瘤中，CSF CTCs数量、ctDNA全基因组的突变基因种类与蛋白质的类型区别于血清，因此在中枢神经系统肿瘤中，检测CSF中的特殊生物标志物应在诊治的全程充分发挥作用。目前仍需要大样本的前瞻性研究来证实CSF的检测是中枢神经系统肿瘤诊治的必要手段。