肿瘤的发生和发展不仅与肿瘤细胞自身有关，更与其所处的肿瘤微环境有密切关系^[1]。肿瘤微环境包括间质细胞、微血管、微淋巴管、组织液、众多细胞因子及抗原提呈细胞如巨噬细胞和树突状细胞(dendritic cell，DC)等非肿瘤细胞和基质^[2-3]。络病理论是中医基础理论的核心组成部分。近年来，随着中医络病学研究的深入，现代络脉系统的框架，既包括神经、体液、微循环和内分泌等结构性网络系统，又包括神经-内分泌-免疫调节等更高层次的功能性网络系统，属于三维立体网络系统^[4]。肿瘤微环境与中医络病理论有着极为相似之处。肿瘤微环境可直接或间接作用于其中浸润的免疫细胞，使其发生表型的改变及抗肿瘤作用的下调^[5]，这都有利于肿瘤的发展及转移。DC是目前已知的体内功能最强的抗原提呈细胞，也是免疫应答的核心环节。因此，肿瘤的发生与肿瘤微环境中DC数量的减少及功能缺陷密切相关^[6]，提示肿瘤对DC有效免疫应答的抑制可能是肿瘤免疫逃逸的机制之一。

DC2.4是通过转染癌基因v-myc和v-raf的C57BL/6小鼠骨髓细胞而建立的永生化细胞株，可以代替DC用于肿瘤和免疫方面的研究^[7]。Wnt信号通路参与调控细胞的生长、分化、迁移和凋亡等生理过程，Wnt通路的异常活化与肿瘤的发生和发展密切相关^[8]。Wnt信号通路被证实是调控免疫细胞生长发育的重要信号通路，能够直接影免疫细胞的生物学功能^[9]。很多研究证明，DC的成熟状态与Wnt/β-catenin信号通路密切相关^[10]。

本研究组前期的研究表明，在中医络病理论基础上形成的化瘀通络方对肺癌微环境中小鼠骨髓来源的DC具有较强的免疫激活作用，但其确切的分子机制尚不清楚。本文通过化瘀通络方作用于肿瘤微环境中的DC2.4细胞，观察其对DC2.4的影响，进一步探讨其与Wnt/β-catenin信号通路的关系。

1 材料与方法 1.1 动物及细胞株

健康成年清洁级SD大鼠16只，雌雄各半，2~4个月龄，体质量(200±30)g，均由西安交通大学医学院实验动物中心提供，按照清洁级动物饲养方法喂养，实验开始前适应1周。Lewis肺癌细胞株购自中国科学院上海细胞库，DC2.4细胞株购自上海研卉生物有限公司。

1.2 主要药品及试剂

化瘀通络方由熟地15 g、当归15 g、白芍10 g、川芎8 g、桃仁9 g、红花6 g、丹参30 g、鸡血藤15 g、莪术15 g、水蛭10 g和丝瓜络9 g组成；以上中药饮片均购自西安交通大学第一附属医院。化瘀通络方的熬制：以上复方总用量为142 g，加水没过药材浸泡15 min，文火煎煮40 min后滤取药液，药渣加同体积水继续煎煮30 min，合并2次所得滤液并浓缩定容至142 mL。此时化瘀通络方药液浓度为1 g/mL，灌入清洁玻璃容器中，封口高压灭菌，4℃冷藏备用。1 mg/mL盐酸肾上腺素购自中国上海禾丰制药，脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)和二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)购自美国SIGMA公司，Wnt/β-catenin通路激活剂SB216763购自美国Cayman Chemical公司，Wnt/β-catenin通路抑制剂XAV939购自美国Enzo Life Sciences公司，RPMI改良型1640完全培养液购自美国Hyclone公司, 胎牛血清购自杭州四季青公司，ECL发光液购自意大利Cyanagen公司，β-catenin兔单克隆抗体购自美国CST公司，抗β-actin兔多克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体购自北京康为世纪公司。

1.3 含药血清的制备

健康成年SD大鼠16只，体质量(200±30)g，全部皮下注射0.01%肾上腺素，1次/d，连续7 d形成血瘀证模型。根据完全随机设计原理，将16只SD大鼠随机分为空白组、低剂量组、中剂量组和高剂量组，每组4只，雌雄对半。按照70 kg成人是200 g大鼠体表面积的56倍计算，大鼠灌胃12.8 g/kg化瘀通络方药液为中剂量组，6.4 g/kg为低剂量组，25.6 g/kg为高剂量组，空白组给等体积生理盐水灌胃，连续灌胃6 d达到血药稳态。于最后1次灌胃后1 h，腹主动脉采血，取上清，各组血清灭活、过滤除菌，-80℃保存备用。

1.4 Lewis肺癌细胞上清液的制备

Lewis肺癌细胞用含20%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的RPMI 1640完全培养液培养，当细胞长到约80%~90%时，用0.25%的胰蛋白酶消化，计数，调整细胞浓度至5×10⁵/mL，接种于10个25 cm²培养瓶中，置于5% CO₂ 37 ℃饱和湿度的细胞培养箱中静置培养48 h后收集上清液，1 000 r/min离心5 min，过滤除菌，-80℃保存备用。

1.5 DC2.4的培养

DC2.4细胞用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的RPMI 1640完全培养液，置于5% CO₂ 37 ℃饱和湿度的细胞培养箱中静置培养，隔天全量换液。传代2~3次，处于对数生长期且状态良好的细胞备用。

1.6 MTT法检测DC2.4细胞增殖

前期已经用MTT法初步筛选出肺癌上清加入最适浓度为40%，最佳作用时间为48 h；含药血清加入最适浓度为20%。

收集对数生长期的DC2.4，0.25%胰蛋白酶消化细胞，计数，调整细胞浓度至2.5×10⁴/mL，接种于96孔培养板，5 000个细胞/孔，终体积为200 μL/孔，按表 1进行分组加药处理，细胞培养第0天开始加入肺癌细胞上清液：其中第1~2组正常换液，第3~8组于每次换液时加入占体积分数40%的肺癌细胞培养上清液；于细胞培养第3天开始加入已制备的低、中或高剂量含药血清(20%)，各组含药血清分别作用48 h后加入5 mg/mL的MTT 20 μL/孔，37℃孵育4 h后吸弃上清，加入DMSO 150 μL/孔，摇床15 min后酶标仪检测各孔吸光度(A_{490 nm})；计算每组细胞增殖率：细胞增殖率(%)= (实验组A值-调零孔A值)/(对照组A值-调零孔A值)×100%。

1.7 细胞形态学观察

收集对数生长期的DC2.4细胞，0.25%胰蛋白酶消化细胞，计数，调整细胞浓度至2.5×10⁴/mL，接种于12孔培养板，每孔2 mL，按表 1进行分组加药处理，各组药物分别作用48 h后光学显微镜下观察各组细胞的形态学差异。

1.8 Western blot法检测β-catenin蛋白表达

收集对数生长期的DC2.4细胞，0.25%胰蛋白酶消化细胞，计数，调整细胞浓度至1×10⁶/mL，接种于10 cm的细胞培养皿，分别按表 1和表 2进行分组加药处理。

各组药物作用48 h后，加入细胞裂解液充分裂解，14 000 r/min 4℃离心20 min，取上清，备用。每组各取11 μL蛋白作蛋白定量，剩余蛋白加入4倍的5×加样缓冲液，吹打均匀后100℃煮沸5 min使蛋白变性，-20℃保存备用。将获得的蛋白样品经不连续的SDS-PAGE凝胶电泳分离后，采用半干转的方法将蛋白转移到PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭后孵育相应抗体，最后经ECL发光显色检测目的蛋白的表达，β-catenin兔抗1 :500稀释，β-actin兔抗1 :1 000稀释，HRP标记的羊抗兔二抗1 :2 000稀释。

1.9 统计学分析

采用SPSS 18.0软件对数据进行分析。数据以均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 倒置显微镜下观察不同处理组DC2.4细胞形态变化

未成熟阴性对照组细胞贴壁生长，细胞形态成不规则菱形或梭形，细胞周围树突状毛刺不明显，是典型的未成熟DC2.4细胞形态；成熟阴性对照组2是经LPS处理成熟后的DC2.4细胞，细胞多数呈梭形，细胞周围树突状毛刺较多，胞内可见点状颗粒，是其分泌的各种细胞因子；空白对照组是和肺癌细胞上清液共培养的DC2.4细胞，细胞数量明显较其他组少，细胞呈不规则菱形，细胞周围树突状毛刺较少，细胞膜颜色深而不光滑，有少量漂浮的死细胞；激活剂组是加入SB216763的树突状细胞，梭形细胞分布较多，细胞周围树突状毛刺明显，细胞颜色较深，细胞内点状颗粒较明显。空白血清组细胞成均匀菱形，细胞周围毛刺较少，和阴性对照组细胞形态相似；低、中和高剂量血清组细胞形态较为相似，梭形细胞分布增多，可见树突状毛刺及胞内点状颗粒(图 1)。

2.2 MTT法检测不同处理组DC2.4细胞存活率

通过MTT法检测不同处理组树突状细胞存活率的结果显示(表 3)，空白对照组的DC2.4细胞存活率与未成熟阴性对照组和成熟阴性对照组比较，差异均具有统计学意义(均P < 0.05)，提示肺癌细胞上清液对DC2.4细胞的存活率具有抑制作用。成熟阴性对照组、激活剂组、空白血清组、低剂量血清组、中剂量血清组和高剂量血清组DC2.4细胞存活率与空白对照组比较，差异均具有统计学意义(均P < 0.05)，而空白血清组与激活剂组、低剂量血清组、中剂量血清组和高剂量血清组比较，DC2.4细胞存活率差异均具有统计学意义(均P < 0.05)，表明正常机体血清具有抵抗肺癌微环境对DC2.4抑制的作用，而含药血清及SB216763可以抵抗肺癌上清液对DC2.4的抑制作用更强。激活剂组和高剂量血清组、低剂量血清组和高剂量血清组以及中剂量血清组和高剂量血清组DC2.4细胞存活率两两比较，差异均具有统计学意义(均P < 0.05)，提示高剂量含药血清较低、中剂量含药血清可以更好地抵抗肺癌上清液对DC2.4的抑制作用，含药血清对DC2.4细胞的作用具有一定的剂量依赖性。

2.3 不同处理组DC2.4细胞中β-catenin蛋白的表达 2.3.1 Wnt/β-catenin通路激活剂对DC2.4细胞β-catenin蛋白表达的影响

加入肺癌上清液后DC2.4细胞中β-catenin蛋白表达下降，而经过化瘀通络方药液作用后，β-catenin蛋白表达升高，尤其是高剂量血清组(图 2)。用Image Lab软件计算出各处理组的蛋白灰度殖，SPSS18.0软件分析显示，成熟阴性对照组较未成熟阴性对照组DC2.4细胞β-catenin蛋白表达上调(P < 0.05)，提示DC2.4细胞成熟过程中伴随着Wnt/β-catenin通路的活化。未成熟阴性对照组与空白对照组比较，β-catenin蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)，而成熟阴性对照组较空白对照组β-catenin蛋白表达上调(P < 0.05)，表明肺癌细胞上清液对未成熟DC2.4细胞Wnt/β-catenin通路无明显作用，而对成熟状态的DC2.4的Wnt/β-catenin通路具有抑制作用。激活剂组、低剂量血清组、中剂量血清组和高剂量血清组与空白对照组比较β-catenin蛋白表达均上调(均P < 0.05)，表明SB216763和化瘀通络方含药血清可以激活DC2.4细胞内的Wnt/β-catenin通路。低剂量血清组、中剂量血清组较激活剂组β-catenin蛋白表达下调，而高剂量血清组较激活剂组蛋白表达上调(均P < 0.05)，表明低、中剂量含药血清激活DC2.4细胞中Wnt/β-catenin通路的能力弱于SB216763，而高剂量含药血清激活DC2.4细胞Wnt/β-catenin通路的能力超过SB216763。低剂量血清组、中剂量血清组和高剂量血清组两两比较β-catenin蛋白表达量差异均具有统计学意义(均P < 0.05)，且剂量越高，蛋白表达量越高。表明含药血清对DC2.4细胞内Wnt/β-catenin通路的激活在一定浓度范围内呈剂量依赖的趋势。

2.3.2 Wnt/β-catenin通路抑制剂对DC2.4细胞β-catenin蛋白表达的影响

肺癌上清组与LPS组比较DC2.4细胞β-catenin蛋白表达下调(P < 0.05)，表明肺癌细胞上清液对成熟DC2.4细胞内Wnt/β-catenin通路具有一定的抑制作用。含药血清组与肺癌上清组比较β-catenin蛋白表达升高(P < 0.05，图 3)，表明含药血清激活DC2.4细胞内的Wnt/β-catenin通路。抑制剂组较含药血清组β-catenin蛋白表达下降(P < 0.05)，提示加入Wnt/β-catenin通路抑制剂XAV939可以拮抗含药血清对Wnt/β-catenin通路的激活。

3 讨论

DC是专职的抗原递呈细胞，在肿瘤免疫中扮演重要角色，DC主要通过增强细胞毒性淋巴细胞的抗肿瘤作用^[11]和合成或分泌一些细胞因子[如白介素-10 (interleukin-10，IL-10)]^[12]以及分泌趋化因子[如酪蛋白激酶(casein kinase 1，CK1)]^[13]等发挥抗肿瘤作用。但由于处于肿瘤微环境中的DC抗原提呈能力往往存在缺陷，无法有效提呈肿瘤抗原激活T细胞以识别和杀伤肿瘤细胞。细胞的一切生命活动都与信号传导有关。Wnt/β-catenin信号通路是DC成熟过程中重要的信号通路之一，与DC的抗原提呈和T细胞刺激功能密切相关。已有研究表明，加入活化剂SB216763激活Wnt/β-catenin信号，可以引起DC内β-catenin积累，DC表型和细胞因子表达上调^[9]。中药单体成分可以在细胞内信号传导水平干预DC细胞的功能，如黄芪多糖有效对抗胃癌细胞上清液引起的对DC分化成熟和功能的抑制^[14]。

近年来化瘀通络法治疗肿瘤已取得一些成就，桃红四物汤对抑制肿瘤血管生成的相关报道较为多见。如杨海燕等^[15]通过检测乳腺癌患者化疗前、后微血管密度(microvessel density，MVD)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表达，认为桃红四物汤可降低其表达来抑制乳腺癌患者肿瘤血管生成。随着肿瘤微环境理论及化瘀通络治疗肿瘤研究的逐步深入，桃红四物汤在肿瘤微环境中的作用研究尚少，因此，本研究组在络病理论的指导下，在桃红四物汤的基础上加入丹参、鸡血藤、莪术和水蛭，增强桃红四物汤活血化瘀和通络消积的作用，同时应用其现代研究中抗肿瘤的作用，以期能增强肿瘤微环境中DC的免疫功能而达到抑制肿瘤的目的。

本研究证实，在肿瘤微环境中肺癌细胞培养上清持续作用的DC2.4细胞较正常培养的DC2.4细胞形态发生变化，培养48 h后可见部分细胞漂浮、皱缩死亡，细胞膜颜色深而不光滑，树突状毛刺很少。这些形态上的变化提示，肿瘤微环境对DC2.4细胞的分化发育起抑制作用。且处于肺癌微环境中的DC2.4细胞存活率下降。本实验结果提示，肺癌细胞上清可以影响DC2.4细胞生长和增殖，这可能是肺癌产生免疫逃避的机制之一。

将DC2.4细胞于肺癌细胞上清液中培养2 d，再分别加入SB216763及不同剂量含药血清作用48 h，倒置显微镜下观察各组DC2.4细胞形态显示，含药血清组细胞多数呈梭形，细胞周围树突状毛刺较多，细胞内可见点状颗粒，细胞向成熟状态发展。这些形态上的变化提示，化瘀通络方对肺癌细胞上清液中DC2.4细胞的分化发育发挥某些作用。对各处理组DC2.4细胞存活率进行测定显示，SB216763组和含药血清各组的DC2.4存活率保持与正常DC2.4细胞同等水平，表明正常机体血清具有抵抗肺癌微环境对DC2.4抑制的作用，而含药血清及SB216763可以抵抗肺癌上清液对DC2.4的抑制作用更强。而低、中和高剂量血清组DC2.4细胞存活率比较提示，高剂量含药血清较低、中剂量含药血清可以抵抗肺癌上清液对DC2.4的抑制作用更强，提示含药血清对DC2.4细胞的作用具有一定的剂量依赖性。

为探讨化瘀通络方含药血清对肺癌微环境中DC2.4细胞激活作用的机制，本研究应用Western blot法检测DC2.4细胞中β-catenin蛋白表达显示，空白血清组β-catenin蛋白表达量与加入肺癌细胞上清液的空白对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，而激活剂组及低、中、高剂量血清组β-catenin蛋白表达高于加入肺癌细胞上清液的空白对照组，而随着含药血清剂量加大，β-catenin蛋白表达上调。在中剂量血清组中加入Wnt/β-catenin通路的抑制剂XAV939，β-catenin蛋白表达下降，提示阻断Wnt/β-catenin通路后，化瘀通络方含药血清不能通过Wnt/β-catenin通路发挥作用。肺癌微环境对DC2.4细胞的生长发育有抑制作用，而活血化瘀复方可以激活肿瘤微环境中的DC2.4细胞，且随着药物浓度加大，这种激活作用越明显，其分子机制可能与激活Wnt/β-catenin信号通路有关。

本研究从DC形态、存活率和DC中β-catenin含量的变化初步揭示化瘀通络方含药血清可能是通过激活Wnt/β-catenin通路而发挥促DC发育成熟的作用。但Wnt/β-catenin通路较为复杂，肿瘤微环境对宿主免疫功能的影响也非常复杂，化瘀通络方激活Wnt/β-catenin通路的具体机制以及非经典Wnt通路是否也参与此过程仍有待进一步研究。