胃癌是消化道常见恶性肿瘤，在全球癌症死亡原因中居第2位^[1]。胃癌细胞的侵袭和转移是患者死亡的主要原因^[2-3]。研究胃癌侵袭转移机制对于早期干预、后期治疗和提高疗效具有重要意义。肿瘤细胞可限定表达某些趋化因子或趋化因子受体，提示趋化因子及受体与肿瘤侵袭和转移密切相关^[4]，然而趋化因子受体在胃肿瘤中的表达无确定结论^[5]。本研究采用免疫组织化学和RT-PCR检测胃癌组织中CXC趋化因子受体4(CXC chemokine receptor 4，CXCR4)和血管内皮生长因子C(vascular endothelial growth factor C, VEGF-C)蛋白和mRNA的表达差异，分析CXCR4在胃癌组织中的表达特点以及与VEGF-C表达的关系，探讨其在胃癌的发生、侵袭和转移过程中的作用。

1 资料与方法 1.1 一般资料

收集海军军医大学附属长海医院胃肠道外科2016年3月至2018年3月290例胃癌根治术后胃癌组织，同时留取距离癌组织>5 cm的正常胃黏膜组织150例(经病理切片证实无肿瘤及增生性病变)为对照。290例胃癌患者中，男性210例，女性80例；年龄32~75岁，中位年龄57岁。对照组患者男性100例，女性50例；年龄33~71岁，中位年龄55岁。患者术前均未行新辅助放化疗，所有标本均经4%甲醛固定，常规石蜡包埋、切片，HE染色，经组织病理确诊，按世界卫生组织(World Health Organization，WHO)标准分型分级^[6]，按国际抗癌联盟(Union for International Cancer Control，UICC)标准行pTNM分期^[7]。

1.2 试剂和方法

鼠抗人CXCR4抗体和鼠抗人VEGF-C抗体均购自美国Santa Cruz公司，稀释度为1 :100。RT-PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司，CXCR4由日本TaKaRa西安海宁生物技术有限公司合成，7500荧光定量PCR仪为美国ABI公司产品。

免疫组织化学染色：4%甲醛固定，常规石蜡包埋，切片后SP染色观察；用PBS代替一抗作阴性对照。

RT-PCR检测：从-80℃取出标本，组织总RNA提取，反转录及RT-PCR均按试剂盒说明书进行。按以下程序进行扩增：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，62℃复性30 s，72℃延伸1 min, 循环40次，72℃延伸10 min。反应结束后取10 μL扩增产物与2 μL 6×缓冲液混合，在1.5%的琼脂糖凝胶上电泳分析。

1.3 结果判断

CXCR4和VEGF-C均以细胞质染色出现棕黄色颗粒为阳性结果，采用半定量积分方法^[8]，每例均随机观察5个高倍视野(×400)。阳性细胞百分率计算：阳性细胞≤5%为0分，6%~25%为1分，26%~50%为2分，51%~75%为3分，>75%为4分。阳性细胞强度计分：无着色为0分，黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。将阳性细胞百分率与染色强度相乘，0~1分为阴性(-)，2~3分为弱阳性(+)，4~5分为中度阳性(++)，6~8分为强阳性(+++)，其中≥2分为阳性表达。

RT-PCR产物经凝胶电泳后，利用凝胶成像分析系统分析处理，CXCR4和VEGF-C分别在173 bp和285 bp出现电泳带。应用Quantity One灰度分析软件检测CXCR4、VEGF-C及相应GAPDH电泳条带灰度吸光度值，并计算相对应系数。

1.4 统计学分析

采用SPSS 19.0统计学软件分析数据。计量资料采用均数±标准差($\bar x \pm s$)表示，两组间均数比较采用t检验。计数资料比较采用χ²检验。相关性分析采用Pearson相关性检验。以P < 0.05为差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 CXCR4与VEGF-C的表达情况

CXCR4表达主要定位于细胞膜和细胞质，VEGF-C表达主要定位于细胞质。290例胃癌组织标本中，细胞膜和细胞质均可见CXCR4和VEGF-C阳性表达，阳性表达率分别为83.3%(241/290)和65.0%(189/290)。CXCR4和VEGF-C在胃癌组织中的表达高于正常胃黏膜组织(图 1)。

2.2 CXCR4表达与临床病理特征的关系

CXCR4在胃癌组织TNM分期Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期患者中的阳性表达率分别为71.7%、84.0%、87.2%和89.6%，差异具有统计学意义(P < 0.05，表 1)。CXCR4在高分化、中分化和低分化患者中阳性表达率分别为76.2%、82.2%和89.1%；随分化程度由高到低，CXCR4的表达呈升高趋势，但组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。CXCR4在腺癌和印戒细胞癌患者中的阳性表达率为87.3%和79.3%(P>0.05)。

2.3 胃癌组织中CXCR4与VEGF-C表达的关系

胃癌组织中CXCR4表达与VEGF-C表达呈正相关(r=0.729，P=0.047，表 2)。

2.4 胃癌组织中CXCR4和VEGF-C mRNA表达

290例胃癌和150例正常胃黏膜组织中，CXCR4 mRNA表达分别为(0.787±0.156)和(0.557±0.175)，VEGF-C mRNA表达分别为(0.717±0.175)和(0.470±0.181)，在胃癌组织中的表达均高于正常胃黏膜组织(t=4.399、4.148，均P < 0.01，图 2~3)。

2.5 胃癌组织CXCR4和VEGF-C mRNA表达与临床病理特征的关系

290例胃癌组织中，CXCR4 mRNA表达量在患者的性别、年龄、分化程度及癌组织浸润深度方面比较，差异均无统计学意义(均P>0.05，表 3)，但在淋巴结转移方面比较，差异具有统计学意义(P < 0.01)。VEGF-C mRNA表达量在患者的性别、年龄及分化程度方面比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)，但在癌组织浸润深度和淋巴结转移方面比较，差异均具有统计学意义(均P < 0.05)。

2.6 胃癌组织中CXCR4和VEGF-C mRNA表达的相关性

290例胃癌组织中CXCR4和VEGF-C mRNA表达量分别为(0.787±0.156)和(0.717±0.175)，两者之间呈正相关(r=0.346，P=0.045)。

3 讨论

趋化因子是具有化学趋化作用的单链小分子蛋白质，有激活和趋化白细胞作用，参与许多疾病的发生和发展^[9]。研究表明，癌细胞的转移和炎细胞的迁移有相似的过程，如涉及细胞趋化和黏附跨内皮迁移等^[10]。趋化因子及其受体存在与炎细胞相似的转移机制。不同的趋化因子对肿瘤的发生和发展发挥不同作用^[11]。SDF-1是一种基质细胞来源的细胞因子，是CXC趋化因子家族成员，相对分子质量为8 000，国际命名为CXCL12，其特异性受体为CXCR4。通过该受体可启动细胞内多种信号转导。SDF-1/CXCR4构成1个细胞信息传递的生物学轴，与肿瘤细胞的生长和转移密切相关。在白血病、乳腺恶性肿瘤、前列腺癌和结肠癌等多种肿瘤细胞中SDF-1/CXCR4高表达^[12]，与肿瘤的生长和转移相关^[13-15]。CXCR4已成为肿瘤诊断和治疗新靶点^[16]。

本研究发现，胃癌组织中CXCR4表达与其他肿瘤组织一样，均位于细胞膜和细胞质中；与胃正常组织比较，胃腺癌和印戒细胞癌都高表达CXCR4。CXCR4表达与肿瘤的恶性程度和预后有关。在难治性转移性前列腺恶性肿瘤中，CXCR4可作为具有强侵袭性的表型。在晚期浸润性膀胱癌中CXCR4 mRNA表达上调，但在表浅性膀胱癌中低表达^[17-18]。本研究发现，随着胃癌分化程度的降低，CXCR4表达有增高的趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)，提示CXCR4表达与胃癌的分化程度关系不密切。CXCR4表达在不同TNM分期的胃癌组织中比较，差异具有统计学意义(P < 0.05)，尤其在有局部浸润和淋巴结转移的Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期胃癌组织中，CXCR4表达高于Ⅰ期，表明CXCR4表达水平与胃癌的侵袭和转移密切相关，可能成为判断胃癌预后的一项重要指标。

VEGF-C可在多种肿瘤细胞中表达，能促进肿瘤新血管形成，是淋巴管生成因子^[19]。针以VEGF-C介导的信号通路为靶点的靶向治疗是近年来的研究热点^[20-21]，同时已经用于临床^[22]。本研究显示，VEGF-C在胃癌组织中阳性表达率达65.0%，且肿瘤组织内CXCR4与VEGF-C表达呈正相关(r=0.346，P=0.045)，通过SDF-1/CXCR4可上调VEGF-C的表达促进肿瘤新血管的生成^[23]。因此，CXCR4和VEGF-C之间可能存在促进血管生成的正反馈通路，如乳腺恶性肿瘤和神经胶质瘤细胞自身分泌VEGF-C，同时VEGF-C能够促进CXCR4高表达，进而导致细胞的趋化作用迁移^[24]。

CXCR4及VEGF-C在胃癌组织中高表达，在胃癌的发生、侵袭和转移过程中起着重要作用。CXCR4可作为判断转移和预后的依据，为胃癌的诊治提供分子靶向目标，对提高胃癌患者治疗效果和延长其生存期具有重要意义。