结直肠癌是全球发病率最高的癌症之一，具有较高的死亡率。目前其发病机制尚有待进一步研究。肌浆网/内质网钙离子转运ATP酶3(sarcoendoplasmic reticulum Ca²⁺ transporting ATPase 3，SERCA3)参与钙离子从内质网到细胞质的转运，并与细胞代谢、神经细胞塑化、基因转录、细胞生长、分化、凋亡、蛋白质折叠和癌变密切相关。为研究SERCA3与结直肠癌发生和发展的关系，本研究收集40例结直肠癌组织标本及癌旁正常组织检测其SERCA3表达，分析其与结直肠癌临床病理特征的关系。

1 资料与方法 1.1 一般资料

收集2009年1月至2013年4月间中国医科大学附属第一医院胃肠外科收治的40例结直肠癌患者。患者均行结直肠癌根治术，40例术后切除标本均经病理检查确诊为腺癌。纳入标准：(1)术前肠镜及病理检查证实为结直肠癌并成功行手术切除的患者；(2)术前未行新辅助化疗或其他生物免疫治疗等。其中男性27例，女性13例；年龄41~76岁，中位年龄57岁。根据世界卫生组织(World Health Organization，WHO)2010分级标准^[1]，高分化7例，中分化24例，低分化9例。根据国际抗癌联盟(International Union Against Cancer, UICC)第8版(2017)TNM分期^[2]，Ⅰ期为7例，Ⅱ期19例，Ⅲ期12例，Ⅳ期(肝转移)2例。取所有患者的癌旁正常组织为对照。

1.2 方法 1.2.1 RNA抽提

从1~10 mg新鲜组织样品中抽提RNA：加入800 μL的Trizol试剂至样品中，样品裂解后，室温孵育5 min；取1 mL上述液体加入0.2 mL氯仿，剧烈振荡后，室温孵育2~3 min。12 000 r/min离心15 min后，取上清无色水相，加异丙醇沉淀RNA；用75%乙醇进行RNA清洗，用无RNase水重新溶解RNA沉淀。获得的RNA溶液保存于-70℃。

1.2.2 实时PCR检测SERCA3

委托中国Takara公司设计并合成SERCA3相关的实时PCR引物，检验引物特异性后，加入PCR微阵列相应的反应孔。用Trizol提纯RNA，DNase Ⅰ消化RNA样品以除去可能存在的基因组DNA，其后RNA纯化使用RNeasy MinElute^TM纯化试剂盒(德国Qiagen公司)，通过琼脂糖电泳和紫外吸收测定法检测RNA的质量、浓度和纯度，最后以RNA为模板，应用SuperScript.Ⅲ逆转录酶(美国Invitrogen公司)合成cDNA，20 μL反应体系加入1.5 μg RNA。PCR微阵列的每孔加入cDNA与SuperArray PCR master mix(美国应用生物系统公司Cat.No.PA-112)充分混合，加10 μL至PCR Array对应的每个孔中。实时定量PCR程序设置为变性95℃10 min，扩增40个循环，95℃ 15 s，60℃ 1 min，采集荧光后分析溶解曲线。数据分析采用ΔΔCt方法。荧光阈值设定为0.15，取PCR Array管家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)的阈值循环数(cycle threshold，Ct)均值为本底，计算ΔCt=Ct均值-管家基因的Ct均值，计算ΔΔCt=ΔCt_{结直肠癌组}-ΔCt_对照组。通过2^-ΔΔCt计算结直肠癌组与对照组对应基因的表达差异^[3]。基因芯片实验由康成生物工程有限公司(中国上海)提供技术服务。

1.3 统计学分析

采用SPSS 12.0软件进行数据分析。组间比较采用t检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 RNA样品提纯鉴定

结直肠癌组和对照组反映RNA样品纯度的紫外吸光度(absorbance，A)比值A₂₆₀/A₂₈₀分别为2.01和2.00。检测RNA样品质量的变性琼脂糖凝胶电泳结果见图 1。结直肠癌组和对照组的28 S核糖体RNA带均亮而浓，前者密度高于后者，可看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其他异型RNA组成。

2.2 结直肠癌组织SERCA3 mRNA表达

实时RT-PCR检测显示，40例结直肠癌组织中SERCA3 mRNA水平较其癌旁正常组织低(P＜0.05，图 2)。

2.3 SERCA3表达与结直肠癌临床病理特征的关系

结直肠癌患者SERCA3 mRNA表达在淋巴结转移和TNM分期方面比较，差异均具有统计学意义(均P＜0.05，表 1)。

3 讨论

SERCA是内质网膜上的跨膜蛋白，亚型包含SERCA 1~3，通过水解ATP将钙离子从细胞质中转移到内质网腔内^[4]。SERCA通过控制内质网内外的钙离子浓度变化的频率幅度调控钙离子稳态(calcium homeostasis)，参与多个通路的信号转导，影响细胞内几乎所有的重要生理过程^[5-6]。SERCA3的异常表达与结直肠腺癌和结肠癌的发展密切相关。既往研究表明，与癌旁正常组织比较，结肠癌组织中SERCA3水平有所下降^[7]。结肠癌SERCA3表达水平的降低与结肠癌恶性程度密切相关^{[6, 8]}。Gou等^[9]通过RT-PCR检测发现，SERCA3 mRNA表达在结肠癌中较原位癌低(P＜0.05)；免疫组织化学检查显示，SERCA3表达在淋巴结侵袭方面，差异具有统计学意义(P＜0.05)。本研究采用实时PCR微阵列测定结直肠癌组织SERCA3的mRNA表达情况发现，结直肠癌SERCA3 mRNA表达较癌旁组织低(P＜0.05)，其表达在淋巴结转移和TNM分期方面比较，差异均具有统计学意义(均P＜0.05)，与上述结果相符^{[6, 8-10]}。本研究结果提示，SERCA3异常表达与结直肠癌的发展密切相关，但其影响结直肠癌的确切机制仍有待进一步研究。