杉木(Cunninghamia lanceolata) 是我国重要的速生造林树种，根据第九次全国森林资源清查结果，我国杉木人工林面积占全国人工林总面积的17. 33%，居主要造林树种人工林的首位^[1]。随着近年来杉木林面积的不断扩大，杉木在同一林地上连栽导致地力衰退等生态问题日趋严重，影响了杉木人工林的可持续经营^[2-3]。大量研究表明，杉木凋落物少且分解慢是导致杉木人工林养分归还少的重要因素^[4]，因此，开展全球变化背景下杉木人工林凋落物分解研究有重要意义。

近年来随着大气排放物的增加，中国已成为世界第三大酸雨地区，酸雨对森林生态系统的危害日趋严重，成为环境科学界急需解决的环境问题。虽然国内外学者围绕酸雨对森林生态系统的影响进行了大量研究，取得了较多研究成果，但以传统工业化生产形成的硫酸型酸雨研究居多^[5]。近年来随汽车数量急剧增加，汽车尾气排放导致大气中氮氧化物(NO_x) 排放加剧^[6]，酸雨类型开始从硫酸型向硫酸与硝酸混合型转变^[7-8]，福建是受酸雨影响较大的省份，一些地区多年降水的pH值在4. 0~5. 5之间^[9]。但有关混合型酸雨对森林生态系统的影响研究相对较少，开展不同酸雨类型对森林生态系统影响的研究显得极为必要。一些研究表明，不同类型酸雨会影响森林土壤微生物组成及其多样性，抑制土壤微生物活性，其中硝酸型酸雨的抑制作用强于硫酸型和混合型酸雨^[10]。但目前有关酸雨类型对杉木人工林生态系统影响的研究较少，特别是不同类型酸雨对杉木凋落物分解过程中土壤微生物的影响研究更少，酸雨类型是否会通过改变土壤微生物的组成及多样性进而对杉木凋落物分解过程产生影响的机制还不清楚，成为当前科学界急需解决的课题。

鉴于此，本研究选取15年生杉木林为研究对象，采用凋落袋分解方法，通过设置不同类型酸雨(硫酸型、硝酸型、混合酸型) 的野外模拟试验，在凋落物叶分解180 d和360 d后取样测定土壤微生物群落组成及其多样性，研究不同类型酸雨对杉木凋落叶分解过程中土壤微生物组成及其多样性的影响规律，为南方酸雨区杉木人工林经营管理提供科学依据。

试验地位于福建省三明市莘口教学林场(26°11′N，117°26′E)，地处武夷山脉与闽中大山带之间，为中亚热带季风性气候，降水充足，温暖湿润。试验区海拔205~500 m，年平均降水量1 670 mm，年平均气温19. 5 ℃，年平均日照时间1 840 h，年积温5 240. 2~6 677. 9 ℃，年无霜期大约300 d，土壤为粉砂页岩发育的山地红壤。试验杉木林2008年造林，初植密度3 000株· hm^-2，2018年进行第1次间伐。13年生杉木林平均胸径15. 67 cm，平均树高14. 73 m，现存密度2 319株· hm^-2。

2021年8月，在13年生杉木林中设3个20 m×20 m的标准地，在每个标准地内设10个1 m×1 m的凋落物收集框，收集杉木凋落枝叶，同时选择标准木进行树干上宿存枝叶的采集。把地面凋落枝叶和宿存枝叶分别进行枝叶分离，风干后将10. 00 g杉木宿存叶和凋落叶分别装入20 cm×20 cm的分解袋中(网孔径为0. 5 mm)，共设1 440个凋落物分解袋。

在每个标准地中随机设10个1 m×1 m的小样方，3个标准地设30个小样方，不同小样方之间设2 m的缓冲带间隔。清除小样方土壤表层的动植物残体后，2021年9月，将凋落物分解袋平铺在不同试验处理小样方中，每个小样方放置24个凋落叶分解袋。

鉴于大气的酸沉降一般包含硝酸型、硫酸型、混合酸型等类型，因此，本研究采用随机区组设计，选择硝酸、硫酸、混合酸3种类型酸进行不同类型酸雨模拟。每个区组设硝酸、硫酸、混合酸和对照4个处理，共设3个区组。分别用硝酸和硫酸配制不同类型酸雨模拟溶液，根据研究地区(福建三明) 的酸雨现状，模拟酸雨的pH值设为4. 5，混合型酸雨按照SO₄^2-与NO₃^-摩尔浓度比8 ∶ 1进行配置。

2021年9月，利用背电动式喷雾器对不同杉木凋落物分解袋进行不同类型酸雨的均匀喷洒，模拟不同类型酸雨对杉木凋落物分解过程的影响。根据福建三明当地的年降水量，确定酸雨的淋溶量。每月月初喷洒1次，从2021年10月到2022年9月共进行12次模拟酸雨喷洒，每次在样方上方60 cm处喷洒4 L配置液，对照处理用等量纯净水进行喷洒。

在凋落物分解袋放置180 d和360 d后，分别对不同试验处理的凋落物分解袋下土壤微生物进行测定。将凋落物分解袋收集后，用土钻挖取3个8 cm表层土壤，去除根系、石块等杂质后，采用四分法挖取4份土壤，混合形成1个土壤样品池，取5. 00 g样品装入自封袋中，供土壤微生物高通量测序。本研究仅探讨不同类型酸雨对杉木凋落叶分解过程中土壤微生物的影响，没有进行宿存枝叶分解过程中土壤微生物的分析。

DNA采用广州美基生物科技有限公司提供的D3142试剂盒提取，提取DNA的样本通过聚合酶链反应(PCR) 进行扩增，以确保获得充足的模板DNA。针对细菌和真菌样本采用了不同扩增策略。细菌使用带有barcode的特异性引物，对16S rDNA的V3~V4区域进行扩增；真菌扩增了ITS的ITS2区域，引物具体序列见表 1。

采用AMPure XP Beads对产物进行纯化，利用Qubit3. 0荧光定量仪对纯化后的DNA进行精确定量，通过ABI StepOnePlus实时荧光定量PCR系统进行定量检测。按照Novaseq 6000测序平台的PE250模式进行测序。使用USEARCH软件(v8. 0. 1623) 进行序列分析，其中操作分类单元(operational taxonomic units，OTU) 分配相似性阈值设为97%。

参考ZHENG et al^[11]的方法进行微生物共现网络分析。根据门的分类层级，筛选出细菌与真菌中的优势菌门。采用R语言编程计算优势菌门之间的相关性矩阵，统计共现网络中节点与边数量。相关系数阈值设定为小于0. 06，P值小于0. 05，以确保统计显著性。纳入相对丰度超过0. 5%的OTU数据，用于生成共现网络图。

将R语言生成的结果导入Gephi软件中，进行可视化处理。选择Fruchterman-Reingold布局算法以优化网络结构的展示效果。节点外观设计以菌门为单位进行配色，以增强视觉区分度。边的颜色根据相关性系数进行着色：正相关关系以红色表示，负相关关系则以绿色表示。

利用Microsoft Excel 2016整理数据；采用SPSS 26进行正态检验、单因素方差分析和多重比较中的最小显著差法(least significant difference，LSD)，比较不同试验处理对土壤微生物的影响；利用多因素方差分析方法分析酸雨类型和凋落物分解时间对土壤微生物α多样性(Sob、Shannon、Pielou、Chao1指数) 的影响；利用皮尔逊相关性分析方法探讨不同测定指标之间的相关性，置信区间为95%；采用R4. 4. 1对土壤微生物群落组成、多样性指数及共生关系进行数据分析，使用Origin 2021和Gephi 0. 10. 1软件绘图。

高通量测序表明，4种土壤细菌获得8 025个OTUs，隶属于29门79纲185目247科322属125种。真菌获得2 842个OTUs，隶属于22门56纲98目186科285属210种，说明测序数据量充足，可以反映出样本中绝大多数微生物物种信息。

根据各序列的物种分类注释结果，将相对丰度在1%以上的微生物群落当成本研究的主要群落，相对丰度在10%以上的微生物群落当成优势群落。从表 2可以看出，在不同类型酸雨土壤细菌群落中有7类主要菌门的平均相对丰度在1%以上，占全部土壤细菌总量的87. 27%，依次分别为酸杆菌门(Acidobacteriota)、变形菌门(Proteobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、放线菌门(Actinobacteriota)、浮霉菌门(Planctomycetota)、疣微菌门(Verrucomicrobiota)、髌骨菌门(Patescibacteria)。不同类型酸雨没有改变凋落叶分解过程中土壤细菌的主要种类组成，但不同类型酸雨处理的土壤细菌部分主要菌门的相对丰度存在差异。凋落叶分解180 d时，硝酸处理后的土壤酸杆菌门、疣微菌门的相对丰度均显著大于对照(P < 0. 05)，不同类型酸雨处理的土壤酸杆菌门的相对丰度大小排序为：硝酸型>硫酸型>对照>混合酸型，而疣微菌门的相对丰度大小排序则为：硝酸型>硫酸型>混合酸型>对照。凋落叶分解360 d时，混合酸处理的土壤酸杆菌门的相对丰度显著大于对照(P < 0. 05)，酸杆菌门的相对丰度大小排序为：混合酸型>硫酸型>硝酸型>对照；硝酸处理的土壤放线菌门的相对丰度显著大于对照(P < 0. 05)，放线菌门的相对丰度大小排序则为：硝酸型>硫酸型>对照>混合酸型。随凋落叶分解时间的延长，不同类型酸雨处理的土壤中优势菌门变化规律出现分化，其中变形菌门、绿弯菌门、浮霉菌门和髌骨菌门的相对丰度受分解时间影响不显著，但土壤绿弯菌门和放线菌门的相对丰度均随凋落叶分解时间的延长呈不同程度的增大趋势，两个菌门平均相对丰度从分解前期不足10. 00%，到分解后期分别上升到11. 36%与10. 76%，跻身优势菌门。可见，酸雨处理后显著改变了土壤部分细菌门的相对丰度。

从表 3可以看出，不同类型酸雨处理的土壤真菌群落中有4类菌门的平均相对丰度在1%以上, 占全部土壤真菌总量的84. 15%，依次分别为子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、毛霉菌门(Mucoromycota)、罗兹菌门(Rozellomycota)。不同类型酸雨没有改变凋落叶分解过程中土壤真菌主要种类组成，但改变了土壤真菌部分菌门的相对丰度。土壤子囊菌门的相对丰度，在凋落叶分解180 d时不同类型酸雨处理差异不显著，在凋落叶分解360 d时硫酸处理显著大于混合酸处理(P < 0. 05)。土壤担子菌门的相对丰度，在凋落叶分解180 d时硫酸和混合酸处理显著大于硝酸处理和对照，在凋落叶分解360 d时硝酸处理显著小于硫酸处理和对照(P < 0. 05)。土壤毛霉菌门的相对丰度，在凋落叶分解180 d时不同类型酸雨处理差异不显著，在凋落叶分解360 d时硫酸处理显著小于其他处理(P < 0. 05)。土壤罗兹菌门的相对丰度，在凋落叶分解180 d时硫酸和硝酸处理显著大于混合酸处理，在凋落叶分解360 d时硝酸处理显著大于其他处理(P < 0. 05)。凋落叶分解时间延长没有改变不同类型酸雨处理土壤真菌主要菌门的相对丰度排序。

图 1为细菌和真菌平均相对丰度排名前15纲的聚类热图。从图 1 (a)可看出，土壤细菌物种组成首先在凋落叶分解180 d和360 d时不同类型酸雨处理之间聚类，然后按照凋落叶分解时间在180 d和360 d时聚类，说明凋落叶分解时间导致土壤细菌物种组成差异大于不同类型酸雨处理引起的差异。从图 1 (b)可看出，土壤真菌纲的组成首先在凋落叶分解360 d时硫酸处理与对照之间聚类，其次与硝酸处理聚类。凋落叶分解180 d时，混合酸处理与对照、硝酸与硫酸处理间分别成对聚类。说明土壤真菌物种组成受凋落叶分解时间的影响更大，受酸雨类型的影响更小。

注：CK、M、N、S分别表示对照、混合酸处理、硝酸处理、硫酸处理，180、360分别表示凋落叶分解180、360 d。 Note: CK, M, N, and S denote control, mixed acid treatment, nitric acid treatment, and sulfuric acid treatment, respectively, and 180 and 360 denote 180 d and 360 d of decomposition of leaf litter, respectively. 图 1 不同类型酸雨处理凋落叶分解过程中土壤微生物组成聚类热图 Fig. 1 Heatmap of soil microbial composition during litter decomposition under different acid rain treatments

图选项

从图 2可看出，不同类型酸雨处理土壤细菌群落α多样性指数存在差异。凋落叶分解180 d时混合酸处理和对照土壤细菌的物种丰富度指数(Sob指数)、物种丰度指数(Shannon指数)、物种均匀度指数(Pielou指数) 和修正后物种丰富度指数(Chao1指数) 均显著大于硝酸处理(P < 0. 05)，混合酸处理Shannon指数显著大于硫酸处理(P < 0. 05)，不同类型酸雨α多样性指数大小排序均为：混合酸型>对照>硫酸型>硝酸型。分解360 d时不同类型酸雨土壤细菌群落α多样性指数大小排序存在差异，Sob指数与Chao1指数大小排序为：混合酸型>硫酸型>硝酸型>对照；Shannon指数大小排序为：对照>混合酸型>硫酸型>硝酸型；Pielou指数大小排序为：对照>硫酸型>硝酸型>混合酸型，混合酸处理土壤细菌Pielou指数显著小于对照(P < 0. 05)。可见，酸雨处理在一定程度上降低了土壤细菌群落的物种多样性。

注：CK、M、N、S分别表示对照、混合酸处理、硝酸处理、硫酸处理。条形图上方字母不同表示差异显著(P < 0. 05)。 Note: CK, M, N, and S denote control, mixed acid treatment, nitric acid treatment, and sulfuric acid treatment, respectively. Different letters above the bars indicate significant differences (P < 0. 05). 图 2 不同分解时间不同类型酸雨处理土壤细菌群落α多样性的比较 Fig. 2 Comparison of soil bacterial alpha diversity at different time points of litter decomposition under different acid rain treatments

图选项

从图 3可看出，不同类型酸雨处理土壤真菌群落α多样性指数存在差异，但差异均未达显著水平(P>0.05)。凋落叶分解时间对部分酸雨处理土壤真菌的Sob指数和Chao1指数有显著影响(P < 0. 05)。

注：CK、M、N、S分别表示对照、混合酸处理、硝酸处理、硫酸处理。条形图上方字母不同表示差异显著(P < 0. 05)。 Note: CK, M, N, and S denote control, mixed acid treatment, nitric acid treatment, and sulfuric acid treatment, respectively. Different letters above the bars indicate significant differences (P < 0. 05). 图 3 不同分解时间不同类型酸雨处理土壤真菌群落α多样性的比较 Fig. 3 Comparison of soil fungal α diversity at differen time points at different time points of litter decomposition under different acid rain treatments

图选项

由图 3可知，凋落叶分解180 d时硝酸处理土壤真菌群落的Sob指数显著大于凋落叶分解360 d (P < 0. 05)。凋落叶分解180 d时混合酸和硝酸处理土壤真菌群落的Chao1指数显著大于凋落叶分解360 d (P < 0. 05)，其他处理土壤真菌群落Chao1指数随凋落叶分解时间的延长也有所下降，但未达到显著水平。随凋落叶分解时间的延长，土壤真菌群落的Shannon、Pielou指数呈下降趋势，但未达到显著水平。

从表 4可看出，土壤细菌群落α多样性受凋落叶分解时间和酸雨类型的显著(P < 0. 05) 或极显著影响(P < 0. 01)。土壤真菌群落Sob指数和Chao1指数受凋落叶分解时间的极显著影响(P < 0. 01) 和酸雨类型的显著影响(P < 0. 05)。分解时间和酸雨类型二者的交互作用对土壤细菌的影响比真菌更显著。

利用主成分分析(PCA) 不同类型酸雨处理的土壤细菌和真菌β多样性，结果见图 4。酸雨类型对土壤细菌群落β多样性的影响大于土壤真菌群落。细菌群落中第1主成分和第2主成分分别解释了土壤细菌变异的50. 89%和15. 85%，硝酸型酸雨处理土壤的聚集效应较差，说明该酸雨处理土壤的细菌群落差异较大。真菌群落中第1主成分与第2主成分分别解释了土壤真菌变异的27. 15%和10. 04%，硝酸型和混合酸型酸雨处理土壤的聚集效应较好，不同类型酸雨处理土壤真菌群落差异较小。

	图 4 不同分解时间不同类型酸雨处理土壤微生物群落的主成分分析 Fig. 4 Principal component analysis of soil microbial communities at different time points of litter decomposition under different acid rain treatments
图选项

对不同类型酸雨处理土壤微生物优势群落以门为单位进行网络分析，结果见图 5和表 5。在共现网络分析图中，红色连线代表两个微生物群落间为合作关系，绿色连线代表竞争关系。通过统计不同类型酸雨处理下红色连线与绿色连线的数量，能够计算出土壤微生物之间合作(正相关) 与竞争关系的占比。结果显示，不同类型酸雨处理下土壤微生物间合作关系占比高低排序为对照＞硝酸型＞混合酸型＞硫酸型，由此可见，不同类型酸雨抑制了土壤微生物之间的合作，加剧了彼此之间的竞争。

	注：红色边表示正相关，绿色边表示负相关; 不同的节点大小代表不同的模块。 Note: red edges indicate positive correlations, and green edges indicate negative correlations; different node sizes represent different modules. 图 5 不同类型酸雨处理土壤微生物群落OTUs共现网络图 Fig. 5 Co-occurrence networks of soil microbial OTUs under different acid rain treatments
图选项

由表 5可知，不同类型酸雨处理土壤微生物共现网络的节点数和模块化程度低于对照，边数、平均度、图密度均大于对照组。综合来说，不同类型酸雨处理土壤微生物共现网络复杂程度排序为：硫酸型＞混合酸型＞硝酸型＞对照，说明不同类型酸雨处理导致土壤微生物之间的互动更加频繁，在酸雨类型由硫酸型向硝酸型转变的过程中，土壤微生物共现网络复杂程度降低，互动减少。

大量研究表明，土壤微生物组成对酸雨有较强的敏感性^[12]，在酸性土壤环境中，土壤细菌和放线菌的生长受到抑制，土壤真菌因其嗜酸性活性得到增强。LIU et al^[13]在亚热带人工林中发现土壤酸化显著减少了细菌的相对丰度，但对真菌相对丰度没有显著影响，这与本研究的结果相似。FAN et al^[14]对白桦天然次生林的研究发现，土壤pH值、总氮和含水率是影响土壤细菌组成的主要环境因子。本研究表明，不同类型酸雨增加了土壤细菌主要群落的相对丰度，硝酸型酸雨提高了土壤中N的输入，使细菌主要群落的相对丰度增加趋势更明显。在凋落物分解过程中，土壤细菌和真菌群落的协同促进了凋落物的分解，微生物群落组成也随凋落物的分解而发生改变^[15]。凋落物分解导致土壤多酚氧化酶活性增强^[16]，多酚氧化酶能催化芳香化合物的氧化分解，促进木质素等顽固性有机质降解，有利于偏好分解有机碳细菌的大量繁殖^[17]。本研究中，随杉木凋落叶分解时间的延长，土壤细菌部分优势种群的相对丰度发生显著变化，而土壤真菌的优势种受酸雨和分解时间的影响相对较少。

酸雨的pH值是影响土壤微生物生长繁殖的关键限制性因子^[18]。大多数土壤细菌与放线菌的适宜生长环境局限于较狭窄的pH值范围，一般接近中性pH值(6. 5~8. 0) ^[19]。当在较低pH值环境时，土壤微生物生长受到显著抑制。尽管真菌可以在微酸环境下生长繁殖，但低pH值环境遏制了土壤一些分解有机碳和氮的真菌活性，从而导致真菌群落多样性降低^[18]。本研究发现，不同类型酸雨对土壤细菌群落多样性的影响明显大于真菌群落，酸雨显著降低了土壤细菌群落的多样性，对真菌群落的影响较小。一般研究认为，随着凋落物的分解，底物基质和微生物群落的代谢有利于土壤微生物群落丰富度和物种数增加^[20]，并抵消部分酸缓冲溶液对土壤微生物的抑制作用^[21]。但本研究发现，杉木凋落叶分解抑制了土壤微生物群落多样性，这可能与杉木凋落叶的组成及其pH值有关，范淇玮等^[22]对9种树种的酸雨缓冲能力研究发现，杉木鲜凋落叶的pH值为4. 20±0. 09，枯凋落叶的pH值为4. 57±0. 08，可见杉木凋落叶分解加剧了土壤的酸化，导致土壤微生物多样性降低，这也解释了本研究对照处理土壤微生物多样性受凋落叶分解时间的影响更为明显。

大量研究表明，酸雨不仅影响了土壤微生物群落组成和多样性^[23]，还引起土壤微生物之间相互作用的改变^[24]。共现网络分析图的复杂性可反映出土壤微生物间的相互关系，共现网络分析图越复杂，说明土壤微生物之间的互动越频繁^[20]。本研究中发现，不同类型酸雨土壤微生物共现网络复杂程度存在差异，酸雨抑制了土壤微生物之间的合作关系，加剧了土壤微生物之间的竞争，使得土壤微生物间的互动更加频繁。这与他人的研究结果类似，当环境中某种资源成为限制因子时，土壤群落中有相同生态位的物种竞争作用增强，由此导致一些物种的消失或多样性降低^[25]。由于酸雨对杉木人工林土壤生态系统的影响是长期的过程，酸雨通过改变土壤pH值、养分有效性、有机质分解及微生物间相互作用，综合影响土壤微生物的组成和多样性，本研究结果只进行土壤微生物组成和多样性1 a的定位试验，仍不足以全面揭示杉木凋落物分解过程中酸雨对土壤微生物的综合影响机制，今后应进行不同类型酸雨对杉木凋落物分解过程的长期观测，以更好地揭示酸雨对土壤微生物组成及其多样性的综合影响机制。

不同类型酸雨没有改变凋落叶分解过程中土壤细菌的主要种类组成，但对凋落叶分解过程中土壤微生物部分优势菌门的相对丰度有显著影响。在杉木凋落叶分解前期酸杆菌门和变形菌门是土壤细菌的优势菌门，在分解后期绿弯菌门和放线菌门也成为土壤细菌的优势菌门，在全年分解过程中子囊菌门和担子菌门始终是土壤真菌群落的优势菌门。凋落叶分解时间和酸雨类型显著驱动了土壤优势菌门的变化，酸雨类型对土壤微生物相对丰度的影响小于凋落叶分解时间。

不同类型酸雨显著降低了土壤细菌群落的多样性，但对土壤真菌群落多样性的影响不显著。酸雨类型对土壤细菌群落β多样性的影响显著大于土壤真菌群落。凋落叶分解时间对土壤微生物多样性的影响显著大于酸雨类型，土壤细菌群落的α多样性受到凋落叶分解时间和酸雨类型的显著影响，而土壤真菌群落的α多样性仅对凋落叶分解时间敏感。

酸雨提高了土壤微生物互作网络的复杂性，促使土壤微生物间互动频率增加，抑制了土壤微生物协作，加剧土壤微生物之间的竞争，酸雨通过强化竞争性驱动了土壤微生物群落从协作模式向竞争模式转变。酸雨类型从硫酸型向硝酸型转变过程中，微生物群落共现网络的复杂度下降，竞争程度减弱。

今后在杉木人工林经营过程中，为减轻酸雨危害，要推广杉木与阔叶树种混交林，增加人工林的物种多样性，同时合理调控林分密度，促进林下凋落物分解，诱导土壤微生物的协作，以减轻酸雨对土壤微生物区系的不利影响。