菌根是植物根系与土壤真菌之间形成的互惠共生体结构^[1]，据估计，约97%的高等植物可与土壤中特定的真菌共生形成菌根^[2]，依据菌根形成的结构与功能差异，主要可分为外生菌根、丛枝菌根、内外生菌根、兰科菌根、杜鹃类菌根、水晶兰类菌根和浆果鹃类菌根7类^[3]。其中，外生菌根真菌(ectomycorrhiza fungi, EMF) 的宿主植物通常是森林的优势树种或常见树种，主要为壳斗科(Fagaceae) ^[4]、松科(Pinaceae)、桦木科(Betulaceae)、杨柳科(Salicaceae) 和龙脑香科(Dipterocarpaceae) 树种^[5]。EMF作为森林生态系统重要的生物组分，对森林的碳固存、养分循环、宿主的促生抗逆、驱动植物群落演替以及促进物种多样性等生态过程具有重要生态作用^{[2, 6]}。因此，EMF作为森林生态系统的重要生物资源，具有不容忽视的潜在生态价值和经济价值。

森林EMF群落受生物因素与非生物因素的影响，呈现出一定的时空分布规律。在时间尺度上，不同植物演替过程和生长季对EMF群落产生重要的影响^[6]。已有研究表明，林龄与土壤真菌群落关联紧密，尤其是EMF群落，如沙地云杉(Picea mongolica W. D. Xu) EMF群落间β多样性存在显著差异，且各林龄阶段具有特定的指示物种类群^[7]；不同林龄樟子松(Pinus sylvestris var. mongholica Litv.) 人工林土壤真菌群落和功能存在显著变化，EMF群落组成和多样性也存在显著变化^[8]。因此，加强森林EMF群落随林龄演变机制的研究将有助于提高区域森林科学的生态管理。

马尾松(Pinus massoniana Lamb.) 作为我国南方地区广泛分布的乡土树种，因具有生长快、产量高和耐旱等特性，在区域用材林和生态林建设过程中发挥着重要的生态作用^[9]。目前有关马尾松EMF在促进宿主植物生长、土壤养分吸收利用以及耐胁迫等方面研究已有大量报道，如接种EMF可有效提高土壤酶活性和养分含量，增强马尾松在胁迫条件下的抗逆性等^[10-11]，此外，不同生境类型中马尾松EMF群落组成也存在显著差异^[12]，但马尾松林EMF多样性随林龄变化的规律却鲜有报道。鉴于此，本研究以黔中地区龙里林场不同林龄马尾松林和针阔混交林(对照) 为研究对象，探讨不同林龄马尾松林及混交林的EMF群落组成、结构及其多样性变化的差异，以期为马尾松林EMF多样性研究奠定理论基础，并为马尾松林经营管理提供科学依据。

研究区位于贵州省黔南布依族苗族自治州龙里县(106°45′18″~107°15′01″E, 26°10′19″~26°49′33″N)，黔中腹地、苗岭山脉中段。该区属中亚热带季风湿润气候，海拔1 100~1 300 m，年平均气温15 ℃，年平均降水量1 090 mm，年平均相对湿度78%，地势东南低，西北高，土壤类型大多以黄壤或黄棕壤为主。该区域内以马尾松、湿地松(Pinus elliottii Englem.) 和火炬松(Pinus taeda Linn.) 等人工林为主，林分结构组成较单一。

在研究区内选择不同林龄马尾松近成熟林(25 a)、成熟林(37 a) 和过成熟林(52 a) 为样地，编号分别为PF1、PF2和PF3，同时选取天然次生马尾松针阔混交林MF (35 a) 作为对照样地，样地基本情况如表 1所示。每个样地内设置20 m×20 m的植被调查样方，采集调查样方的立地条件和植物群落信息，对乔木胸径、冠幅和树高等指标进行测量，马尾松树龄采用生长锥进行代表木测定。每个样地随机选取长势相对一致且空间距离大于3 m的马尾松目标树，按照“索根法”采集马尾松树干基部半径1.0~1.5 m内20 cm土层的2段以上的20 cm长根系样品^[13]，共采集35份马尾松根系样品，放入4 ℃冰盒中，带回室内，加入干燥硅胶后保存、备用。

利用土钻(4.5 cm) 在每块样地内按5点取样法采取土壤样品，过2 mm孔径筛子，均匀混合后用于土壤理化性质测定。土壤有机碳(soil organic carbon, SOC) 含量采用重铬酸钾氧化法测定，全氮(total nitrogen, TN) 含量采用半微量凯氏定氮法测定，全磷(total phosphorus, TP) 含量采用钼锑抗比色法测定，土壤pH值按照水土比为2.5:1的电位法测定；速效磷(available phosphorus, AP) 含量采用双酸(H₂SO₄-HCl) 浸提-钼锑抗比色法测定，速效钾(available potassium, AK) 含量采用火焰分光光度法测定^[14]。不同林龄马尾松林样地土壤理化性质如表 2所示。

用镊子挑出根系样品，用剪刀剪成3~5 cm小段，自来水反复清洗后转入加少量清水的干净培养皿中，置于体式显微镜下(Motic China Group Co., Ltd, SMZ-171, 中国)，根据菌根形态、颜色、分支数、有无菌丝及菌丝形状等对菌根进行初步分类，记录其形态特征和数量并拍照。每种形态菌根挑取1~2个根尖放入含200 μL无菌水的离心管中(3个重复)，置于-20 ℃冰箱中保存。

采用改进十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethyl ammonium bromide，CTAB) 法对样品中的DNA进行提取，以内转录间隔区(internal transcribed spacer, ITS) 的ITS1-F (5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′) 和ITS-4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′) 作为引物对真菌rDNA的ITS区段进行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR) 扩增。PCR体系为25 μL体系。所有的PCR扩增产物均取2 μL经质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳检测。检测合格后的扩增产物送样至生工生物工程(上海) 股份有限公司进行测序。

用Excel 2019软件整理数据，用SPSS 25.0软件对不同林龄马尾松林的土壤理化性质进行单因素方差分析，最小显著差异法(least significant difference method, LSD) 多重比较检验不同林龄马尾松林土壤理化因子和多样性指数差异的显著性。用联川生物云平台制作Veen图，R4.1.3内置vegan包metaMDSP、anosim函数进行非度量多维尺度(non-metric multidimensional scaling, NMDS) 相关分析，ggplot2绘图，用Canoco (version 5) 软件对环境因子与不同林龄马尾松林EMF群落结构进行相关性分析。

不同林龄马尾松林EMF群落的稀释曲线和韦恩图如图 1所示。从图 1(a) 可以看出，不同林龄马尾松林的EMF群落的稀释曲线逐渐趋于平缓，表明此次采样数量能够真实反映采样地情况。在功能性可操作分类单元(operational taxonomic unit, OTU) 水平上制作韦恩图[图 1(b)]，不同林龄马尾松林和针阔混交林EMF中共鉴定出48个OTUs；PF1、PF2和PF3样地中鉴定出EMF的OTUs数分别为13、18和15，MF样地中共鉴定出17个OTUs。不同林龄马尾松林EMF特有种共34个，表明马尾松在不同林龄阶段存在大量特有EMF。

	注：(b) 图中的数值表示物种丰富度。Note: the numerical value in the figure (b) indicates species richness. 图 1 不同林龄马尾松林外生菌根真菌的物种稀释曲线和韦恩图 Fig. 1 Species dilution curve and Venn diagram of EMF in Pinus massoniana forests at different stand ages
图选项

不同林龄马尾松外生菌根根尖ITS区段经BLAST进行DNA序列比对，132条有效DNA序列经鉴定共有48个OTUs与目前已知的种类相似度较高，隶属于担子菌门(Basidiomycota) 和子囊菌门(Ascomycota) 的15科21属(表 3)。其中，担子菌门和子囊菌门的OTUs所占比例分别为81.11%和18.89%。

不同林龄马尾松林的EMF在属水平上的相对丰度和在门水平上的丰富度比例如图 2所示。从图 2 (a) 可以看出，不同林龄马尾松林EMF的群落组成结构存在明显差异。其中，PF1的EMF群落优势属分别是棉革菌属(Tomentella) 和红菇属(Russula)；PF2的EMF群落优势属为红菇属、棉革菌属、Phialocephala和角孢革菌属(Tylospora)；PF3的EMF群落优势属为棉革菌属；MF的EMF群落优势属分别为毛皮革菌属(Piloderma)、糙缘线革菌属(Amphinema)、棉革菌属和蜡蘑属(Lactarius)。随着林龄变化，马尾松林EMF群落优势属的组成结构存在明显差异，且与对照的差异更为明显。由图 2 (b) 可知，担子菌门与子囊菌门真菌在不同林龄马尾松林所占的丰富度比例不同，随林龄变化呈现此消彼长的变化趋势，担子菌门真菌为马尾松林EMF优势类群。

	图 2 不同林龄马尾松林的外生菌根真菌相对丰度和丰富度比例 Fig. 2 Relative abundance and abundance ratio of EMF in Pinus massoniana forests of different ages
图选项

不同林龄马尾松林EMF群落的Shannon-Wiener指数、Pielou指数、Simpson指数、Chao2指数均低于针阔混交林(表 4)，PF2的Shannon-Wiener指数和Simpson指数均高于PF1和PF3，而MF的EMF群落多样性高于马尾松人工林，这表明马尾松人工林在成熟林阶段的EMF群落多样性相对较高。不同林龄马尾松林EMF群落的Sorensen相似性指数和Jaccard相似性指数如表 5所示，PF1、PF2和PF3的EMF群落相似，而PF1与PF2、PF2与PF3的EMF群落结构最为相似，Jaccard相似性指数分别为0.242和0.194。

根据样本中的物种信息进行非度量多维尺度分析，结果如图 3 (a) 所示，Stress=0.001 6，这表明该排序能准确反映样本数据排序，且效果良好；不同林龄马尾松林样本基本分开，同一样地样点相对聚集，这表明不同林龄马尾松林EMF群落组成存在明显差异。

	图 3 马尾松外生菌根真菌群落排序非度量多维尺度分析及其与土壤因子关系的冗余分析 Fig. 3 NMDS of EMF community ranking and RDA analysis between soil factors and EMF communities of Pinus massoniana
图选项

不同林龄马尾松林EMF群落(属水平) 与环境因子的冗余分析(redundancy analysis, RDA) 结果如图 3 (b) 所示，第一轴解释率43.86%，第二轴解释率36.95%，总解释率可达到80.81%，可以反映实际情况。土壤pH值和TP含量对EMF群落多样性有显著影响(P < 0.05)，土壤pH值、TP、TN和SOC含量对MF的EMF群落多样性具有显著正相关影响(P < 0.05)，对PF1、PF2和PF3的EMF群落多样性产生负相关影响(P < 0.05)；土壤AP含量对PF3的EMF群落多样性产生显著正相关影响(P < 0.05)；土壤AK含量与PF1、PF2的EMF群落多样性显著正相关(P < 0.05)，而对PF3和MF的EMF群落多样性呈显著负相关关系(P < 0.05)。

在不同林龄马尾松林中共鉴定出EMF 48个OTUs，隶属于15科21属，担子菌门真菌是马尾松EMF的绝对优势真菌，占所有菌根真菌的81.11%，其余为子囊菌门真菌。这与松属(Pinus) 树种EMF多样性的研究结果一致^[15]，体现了担子菌门真菌在森林生态系统中的重要地位。但在科尔沁沙地不同林龄樟子松EMF多样性的研究中^[16]，子囊菌门的相对丰度高于担子菌门，与本研究结果不一致，这可能是因为该研究的生境为半干旱的沙地生境，土壤条件属胁迫生境，子囊菌门真菌的进化及其物种多样性高于担子菌门，由于子囊菌群里的许多腐生真菌可通过分解土壤中难降解的有机质，提高土壤养分利用率^[16]，从而有利于宿主对胁迫环境的适应。

植物群落的演替阶段、林龄和季节变化等时间变化梯度影响着EMF群落组成结构^[6]。本研究中，不同林龄马尾松林EMF的物种丰富度随着林龄增加呈现出先升高后降低(单峰型) 的变化趋势，这与郭米山等^[17]在呼伦贝尔樟子松EMF多样性研究的变化规律一致。不同EMF在不同生境的生理特性存在较大差异，当森林发展到一定阶段，EMF多样性较为丰富并达到中等或较为稳定的状态^[18]，由于高林龄郁闭度高于其他林龄，宿主植物根系水分、营养物质等竞争较大，则相对应地表现在不同林龄EMF物种中。不同树种生理、生长特性以及生境特征等因素可能造成研究结果不同，如赵珮杉等^[16]对科尔沁沙地樟子松EMF的研究结果表明，根内真菌多样性指数随林龄的增加而不断增大，与本研究结果存在差异。林龄可通过多种途径(影响林木生理特性、林地土壤性质等) 直接或间接改变EMF对植物根系的侵染程度，进一步影响EMF群落组成^[19]。本研究中，不同林龄马尾松林EMF的群落组成结构存在明显差异，马尾松人工纯林EMF的优势种主要为棉革菌属和红菇属，而针阔混交林主要以Piloderma、糙缘线革菌属、棉革菌属和乳菇属(Lactarius) 为主。棉革菌属是马尾松林中占主导地位的EMF，在针叶和阔叶林中普遍存在；雷公山自然保护区棉革菌属在各林分均有分布，表明其可能与林分形成和发育密切相关^[20]。红菇属作为常见的EMF，在松科、壳斗科和杉科(Taxodiaceae) 树种的生长发育过程中发挥重要作用，与本研究结果相一致^[21]。优势属在不同林龄林分中的分布有所差别，这是由林分的生理状况决定的，相同生态位的EMF会因为寄主的需求改变而产生替代或失去优势地位；不同林龄人工林中EMF群落动态的明显变化很可能是优势菌群相互竞争的结果^[19]。随林龄变化，马尾松人工林的EMF优势属改变，但其多样性变化并不显著，这也体现了真菌多样性在环境变化中的弹性及稳定性。同时MF中的EMF类群与PF2存在差异，MF中较为丰富的树种多样性可能会提高EMF多样性，因此，应关注EMF对不同宿主植物及环境变化的响应，进一步探究EMF的生态价值。

土壤作为影响植被生长的重要因素，其理化性质影响植物根系真菌群落组成。土壤环境与不同林龄马尾松林EMF群落多样性的相关性分析表明，pH值和TP含量对EMF群落多样性有显著影响。EMF具有嗜酸性，偏好于酸性环境^[7]，低pH值土壤有利于形成特定类型EMF并增加外生菌根根长。马尾松通过分泌有机酸使土壤环境酸化，改变了土壤中的其他环境因素和林下植被结构，从而改变EMF群落结构^[22]。因此，pH值对EMF的形成及群落结构有重要影响。TP在酸性土壤中含量较高，通常以不能被植物吸收利用的难溶状态存在，因此，磷在土壤中流动性较小。王倩等^[23]在广西凭祥红锥-马尾松混交林EMF多样性的研究表明，土壤中TP是决定菌根真菌发育和侵染的关键因子，EMF通过分泌质子和有机酸活化难溶性磷酸盐，并将其吸收储存于菌套中，受缺磷胁迫时，通过水分、代谢抑制等将菌套中的磷供宿主植物吸收利用^[24]。

本研究揭示了马尾松林具有相对较高的EMF群落多样性，不同林龄马尾松林EMF群落间差异明显，但由于调查区域和样地选取数量的限制，有关不同林龄马尾松林EMF群落演变生态机制的研究仍有待进一步深入。林龄是影响马尾松林EMF群落演变的重要因素，从林龄角度去探索不同阶段马尾松人工林EMF群落多样性的变化规律，可为马尾松人工林的科学经营管理提供参考，为进一步保护和利用马尾松林EMF多样性资源提供科学依据。