樟树[Cinnamomum camphora (L.) Presl]属樟科(Lauraceae)常绿乔木，是国家Ⅱ级重点保护野生植物之一^[1]。主要分布于南方地区，福建、江西、贵州等地种植最为广泛^[2-3]。樟树材质致密坚硬、光滑美观，是制造家具、工艺雕刻品的上等木材；叶片内含有丰富的化学成分，可提取出樟脑、精油和芳香油等，价值极高；樟树四季常绿，枝叶茂盛，可以吸附灰尘和抵抗SO₂，是园林绿化、行道树和景观防护林的优良树种^[4-7]。随着樟树人工培育和栽培面积的增加，樟树病害也日益显现，其中仅南平顺昌发现得溃疡病的樟树面积就高达20 hm^2[8-9]，严重影响了樟树的种植和发展。樟树溃疡病，感病初期产生近圆形的变色病斑，病斑扩展较快形成梭形病斑，其后出现典型的水泡状，失水后病斑干缩凹陷，并出现黑色子实体。整个树干或半边树干的发黑，最后引起整株植株的死亡^[10-11]。

目前，国内外对小新壳梭孢(Neofusicoccum parvum)所引起的溃疡病报道主要有：桉树溃疡病^[12]、油桐叶枯病^[13]、南美杉溃疡病^[14]、核桃溃疡病^[15-18]、柏木枯萎病^[19]、澳大利亚松树溃疡病^[20]等。为了明确引起福建省的樟树溃疡病病原菌小新壳梭孢^[21]的生物学特性，本研究对供试的菌株进行生物学特性测定和化学杀菌剂的筛选，掌握其生存条件并筛选出有效的农药，为后续防治樟树溃疡病提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 供试菌株

樟树溃疡病致病菌菌株JY-5(Neofusicoccum parvum)^[21]，保存于福建农林大学森林保护研究所。

1.2 供试培养基

参照方中达^[22]和刘秀娟等^[23]的方法，配制马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)、马铃薯蔗糖琼脂培养基(PSA)、水琼脂培养基(WA)、查氏培养基(CDA)、麦芽琼脂培养基(WEA)、燕麦琼脂培养基(OMA)、玉米琼脂培养基(CMA)、樟树叶片煎汁培养基(CLA)、樟树枝干煎汁培养基(CBA)。

查氏培养基(碳源)：碳源5 g，磷酸二氢钾0.5 g，硫酸镁0.5 g，硝酸钠1 g，琼脂15 g，蒸馏水1 000 mL。

查氏培养基(氮源)：葡萄糖5 g，磷酸二氢钾0.5 g，硫酸镁0.5 g，氮源1 g，琼脂15 g，蒸馏水1 000 mL。

1.3 菌株的生物学特性测定 1.3.1 菌落生长速度及孢子萌发时间测定

用6 mm打孔器取边缘菌饼接到PDA平板中央，28 ℃培养箱培养，每隔12 h用十字交叉法测量菌落直径，3次重复，测定菌落生长。

用无菌水洗下枝干上的子实体，调节孢子悬浮液浓度至1×10⁶个·L^-1。采用玻片法，吸50 μL滴在涂有PDA的玻片上，置于培养皿中28 ℃保湿培养，每隔1 h在显微镜下观察，统计萌发率(200个)，3次重复。

1.3.2 菌丝和分生孢子致死温度测定

取6 mm菌饼挑入装有1 mL无菌水的2 mL离心管中，分别置于40、45、50、55、60 ℃的水浴锅中水浴10 min，转接到PDA培养基上，28 ℃恒温培养，观察菌丝生长情况，每处理重复3次，测定菌丝致死温度。

吸取1 mL孢子悬浮液于2 mL离心管中，置于不同温度水浴锅中水浴10 min，吸50 μL孢子悬浮液涂布在含有PDA培养基玻片上，28 ℃恒温保湿培养，观察孢子萌发情况，每个处理重复3次，测定孢子致死温度。

1.3.3 温度对菌丝生长、孢子萌发的影响

用6 mm打孔器取菌落边缘菌饼，接种在PDA平板中央，分别置于5、10、15、20、25、28、30和35 ℃的恒温培养箱进行黑暗培养，每个处理重复3次，在48 h后用十字交叉法测量菌落直径。

吸取50 μL孢子悬浮液，滴在涂PDA培养基的玻片上，分别置于以上温度的培养箱中保湿培养，每个处理重复3次，6 h后观察记录孢子萌发数，统计萌发率。

1.3.4 培养基对菌丝生长、孢子萌发的影响

用6 mm打孔器取菌落边缘菌饼，分别接种在PDA、PSA、WA、CDA、WEA、OMA、CMA、CLA、CBA共9种培养基上，置于28 ℃培养箱黑暗培养，每个处理重复3次。48 h后用十字交叉法测量菌落直径。

吸取50 μL孢子悬浮液，分别滴在涂以上9种培养基的玻片中央，置于28 ℃培养箱保湿培养，每个处理重复3次，6 h后观察记录孢子萌发数，统计萌发率。

1.3.5 碳氮源对菌丝生长、孢子萌发的影响

以查氏培养基为基础培养基，碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、淀粉、甘露醇；氮源为硝酸钠、硝酸钾、硝酸铵、硫酸铵、氯化铵、甘氨酸、蛋白胨、牛肉浸膏。取6 mm的菌饼分别接种在含不同碳氮源的培养基中央，不加碳氮源的为对照，每个处理重复3次，28 ℃培养48 h后用十字交叉法测量菌落直径。

吸取50 μL孢子悬浮液，分别滴在涂有不同碳氮源培养基的玻片中央，置于28 ℃培养箱保湿培养，每个处理重复3次，6 h后观察记录孢子萌发数，统计萌发率。

1.3.6 pH值对菌丝生长、孢子萌发的影响

用0.1 mol·L^-1的氢氧化钠和盐酸溶液，将PDA培养基pH值调为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0和13.0。将6 mm菌饼接种于不同pH值的PDA平板中央，28 ℃培养48 h后用十字交叉法测量菌落直径，每个处理重复3次。

吸取50 μL孢子悬浮液，分别滴在不同pH值的PDA培养基玻片中央，28 ℃培养6 h后观察记录孢子萌发数，每个处理重复3次，统计萌发率。

1.3.7 光照对菌丝生长、孢子萌发的影响

将6 mm菌饼接种在PDA平板中央，分别置于28 ℃全光照、12 h光暗交替、全黑暗的条件中培养48 h后，用十字交叉法测量菌落直径，每个处理重复3次。

吸取50 μL孢子悬浮液，滴在涂有PDA培养基的玻片中央，分别置于不同光照条件的28 ℃培养箱中保湿培养，6 h后观察记录孢子萌发数，统计萌发率，每个处理重复3次。

1.3.8 湿度对孢子萌发的影响

使用浓硫酸和无菌水设置不同的湿度^[22]，将相对湿度分别调至47%、58%、65%、72%、88%、100%以及水滴共7个处理。吸取50 μL孢子悬浮液于灭菌玻片上，快速风干后置于干燥器中，28 ℃恒温培养，每个处理重复3次，6 h后观察统计孢子萌发状况，并统计萌发率。

1.4 室内药剂筛选 1.4.1 供试药剂

试验所使用的药剂见表 1。

1.4.2 不同浓度药剂对病原菌菌丝生长的影响

将活化培养2 d的供试菌株用直径6 mm的打孔器取边缘菌饼，将菌饼接种于各浓度含药平板中央，以加无菌水的平板为对照，每个处理重复3次，28 ℃培养28 h测定菌落直径，计算相对抑制率^[24-25]，应用IBM SPSS Statistics 21.0分析软件，求得毒力回归方程、半最大效应浓度(concentration for 50% of maximal effect，EC₅₀)、90%最大效应浓度(concentration for 90% of maximal effect，EC₉₀)和相关系数(R²)。

$ 菌丝生长抑制率/\% = \frac{{对照菌落直径 - 处理菌落直径}}{{对照菌落直径 - 菌饼直径}} \times 100 $

1.4.3 不同浓度药剂对病原菌孢子萌发的影响

吸取50 μL孢子悬浮液滴在含药PDA玻片表面置于玻璃培养皿中，在28 ℃保湿培养，6 h后镜检观察，记录萌发率，每个处理重复3次。计算孢子萌发率和孢子萌发抑制率，用SPSS 21.0计算出每种药剂对孢子萌发抑制率的EC₅₀值和EC₉₀值。

$ 孢子萌发率/\% = 孢子萌发数/计数总数 \times 100 $

$ 孢子萌发抑制率/\% = \frac{{对照孢子萌发率 - 处理孢子萌发抑制率}}{{对照孢子萌发率}} \times 100 $

1.5 室内盆栽药效试验 1.5.1 供试试剂及材料

供试试剂：精甲·咯菌腈、戊唑醇、氟硅唑、多菌灵。供试材料：健康的2年生樟树幼苗。

1.5.2 不同浓度药剂对溃疡病的保护作用

设置药剂浓度为400、200、100 mg·L^-1，选取健康的2年生樟树幼苗，依次进行喷雾处理，以喷清水为空白对照，自然风干，每个处理重复6次。24 h后将供试菌株采用针刺法进行活体接种，接种后置于人工气候室(温度28~30 ℃，相对湿度95%~100%)保湿培养^[26]。待14 d后空白对照充分发病，测量各株病斑长与宽，并利用椭圆面积公式，计算病斑扩展面积，统计不同浓度下不同药剂的抑制率。

1.5.3 不同浓度药剂对溃疡病的治疗作用

选取健康的2年生樟树幼苗，将菌株采用针刺法进行活体接种，置于人工气候室(温度28~30℃，相对湿度95%~100%)保湿培养。将药剂浓度设置为400、200、100 mg·L^-1，2 d后待健康植株开始发病，依次进行喷雾处理，以喷清水为空白对照，自然风干，每个处理重复6次。待14 d后空白对照充分发病，测量各株病斑长与宽，并利用椭圆面积公式，计算病斑扩展面积，统计不同浓度下不同药剂的抑制率。

1.6 数据分析

取多次处理后的平均值，用SPSS软件进行单因素分析，用Duncan分析法分析显著性。图表在Microsoft Excel 2017和Origin 7.5绘制完成。

2 结果与分析 2.1 菌落生长速度及孢子萌发时间

菌落的生长和分生孢子萌发结果如表 2和表 3所示，菌株JY-5在48 h时菌落直径达到7.41 cm，分生孢子的萌发率在6 h达到92.03%。

2.2 菌丝和分生孢子致死温度

菌落直径和分生孢子萌发的致死温度试验结果如表 4所示，温度达到40 ℃以上菌丝生长和孢子萌发都大幅下降，在50 ℃时均不再生长，即50 ℃是菌丝和分生孢子的致死温度。

2.3 温度对菌丝生长、孢子萌发的影响

如图 1所示，温度对病原菌JY-5的菌落和孢子萌发均有显著的影响，当温度30 ℃时，菌丝生长最快，菌落直径为8.13 cm，孢子的萌发率也高达95.64%。在30 ℃前，随着温度的升高，菌丝生长速度逐渐加快，菌落直径越来越大，温度高于30 ℃后，菌丝生长受抑制，菌落直径急剧下降。温度对孢子萌发的影响与菌丝一致，所以30 ℃为菌株生长和萌发的最适温度。

2.4 培养基对菌丝生长、孢子萌发的影响

如图 2所示，菌株菌落直径和孢子萌发率在PDA和PSA培养基上无显著性差异，菌丝致密颜色为白色，菌落有环状形态，不产生色素，但在PDA上菌落直径7.40 cm，孢子萌发率92.11%，均为最大值。在WA培养基上生长最差，菌丝近透明状，孢子萌发率也最低。

2.5 碳源对菌丝生长、孢子萌发的影响

如图 3所示，不同的碳源对菌株JY-5菌落直径和孢子萌发影响显著。在无碳源的查氏培养基上，菌落直径最小(3.21 cm)，孢子萌发率最小(25.04%)。不同碳源对菌丝的生长都有一定的促进作用，以葡萄糖为碳源的培养基，菌丝生长茂密，菌落直径和孢子萌发率均为最大，分别为6.73 cm和79.08%。

2.6 氮源对菌丝生长、孢子萌发的影响

不同氮源对菌株JY-5的菌落直径和孢子萌发影响结果如图 4所示，不同氮源对JY-5的生长影响非常明显，除硫酸铵外均对菌落生长和孢子萌发有促进作用。在添加蛋白胨和牛肉浸膏为氮源的培养基上，气生菌丝相对较密，菌落直径和孢子萌发也处于最高水平，菌落直径分别为6.87和6.95 cm，在蛋白胨中孢子萌发率达到91.14%。

2.7 pH值对菌丝生长、孢子萌发的影响

在不同pH值的培养基上，JY-5菌丝生长和孢子萌发如图 5所示。菌落在pH值4.0~13.0之间均可以生长，在pH值为7时，菌落直径和孢子萌发率均达到最大值，菌落直径为8.27 cm，孢子萌发率达93.85%，之后随着pH值的增大，菌丝生长和孢子萌发率都渐渐下降，在碱性条件下会受到抑制。

2.8 光照对菌丝生长、孢子萌发的影响

如图 6所示，在不同光照条件下，菌株JY-5的菌落直径差异显著。在全光照条件下，菌落直径最大，达8.42 cm，光暗交替下，菌落直径为7.78 cm，在黑暗条件下培养，直径为7.40 cm，菌丝致密、白色。在全光照、光暗交替、黑暗3个条件下，孢子萌发率分别为89.01%、88.40%、89.51%，差异不明显。全光照最适合JY-5的菌丝生长和孢子萌发。

2.9 湿度对孢子萌发的影响

如图 7所示，菌株JY-5的孢子在相对湿度低于88%时，萌发率较低，小于20%。当相对湿度大于88%时，随着相对湿度的增大，孢子萌发率快速增加，当相对湿度达到100%时，孢子萌发率为79.62%。在水滴条件下，孢子萌发率最高，达到89.33%。由此可见，分生孢子萌发需要高湿度条件。

2.10 化学杀菌剂对JY-5菌落的影响

12种药剂对菌株JY-5的菌落形态影响如图 8所示，不同浓度的药剂对菌株JY-5的菌落大小和菌丝疏密程度均有不同程度的影响。在精甲·咯菌腈、苯甲·咪鲜胺和异菌·氟啶胺高浓度药剂处理下菌丝变密；在多菌灵、吡醚·甲硫灵和福美双这3种药剂的处理下，菌落轻微致畸，菌丝颜色变浅黄色；在唑醚·代森联和啶酰菌胺的含药培养基上，菌丝较为稀疏。

12种药剂对JY-5菌落表现出不同的抑菌效果，且抑菌效果与药剂浓度成正相关(表 5)。其中抑菌效果最好的是精甲·咯菌腈(EC₉₀=0.129 mg·L^-1)，此外戊唑醇、氟硅唑和多菌灵的EC₉₀＜1.0 mg·L^-1，抑菌效果最差的药剂是啶酰菌胺(EC₉₀=55 309.942 mg·L^-1)。

2.11 化学杀菌剂对JY-5孢子萌发的影响

从表 6可知，12种药剂对JY-5孢子萌发均具有抑制作用。其中抑制效果较好的为精甲·咯菌腈、戊唑醇和多菌灵，EC₉₀分别为1.941、2.302和4.906 mg·L^-1，抑菌效果最差的是啶酰菌胺(EC₉₀=69 081.287 mg·L^-1)。

2.12 室内盆栽药效试验

不同药剂对JY-5菌株引起的溃疡病的防治效果差异显著，接种14 d后病斑扩展情况如表 7所示，防治效果随着药剂浓度的提高而增加，且在同种处理下，药剂的保护作用均比治疗作用高。各处理均有保护作用，在精甲·咯菌腈、戊唑醇和多菌灵400 mg·L^-1处理下，抑制率分别为92.43%、89.55%和92.94%。在治疗效果试验中，除氟硅唑和多菌灵在100 mg·L^-1处理下不具治疗作用，其他处理均有治疗作用，在精甲·咯菌腈和戊唑醇400 mg·L^-1处理下，抑制率分别为87.50%和82.09%。

3 讨论与结论

通过对樟树溃疡病小新壳梭孢(Neofusicoccum parvum)的生物学特性进行了较为系统的研究，结果显示，菌株JY-5的最适生长温度为30 ℃，致死温度为50 ℃；在PDA和PSA培养基上，菌丝旺盛，孢子萌发率处于最高水平。最适碳氮源为葡萄糖，最适氮源为蛋白胨和牛肉浸膏，对不同pH值的适应性强，在pH 4.0~13.0条件下均可生长，最适pH值为7.0。在全光照条件下，菌落生长状态最佳，孢子萌发率最大，在水滴中，孢子萌发率达到最大89.33%。尹万瑞等^[16]对核桃枝枯病病原菌新壳梭孢生物学特性的研究，认为以PDA为培养基、温度25~30 ℃、pH值7~8、葡萄糖为碳源是最佳培养条件，与本研究一致。杨秀梅等^[27]对高山杜鹃枯梢病病原菌小新壳梭孢研究显示最适生长温度为25 ℃，以蔗糖为碳源、硫酸铵为氮源时菌丝生长最好。黎肇家等^[28]对小新壳梭孢研究得出胡萝卜素培养基最有利于菌丝和孢子的生长。由此可知，小新壳梭孢寄主不同，其生物学特性也有所差异，可见该病原菌具有较强的环境适应能力。

化学农药是植物病害防控的重要手段，从12种药剂对病原菌的抑菌试验结果可以得出，精甲·咯菌腈对病原菌抑制效果最佳，EC₉₀为0.129 mg·L^-1，此外戊唑醇、氟硅唑和多菌灵3种药剂的EC₉₀＜1.0 mg·L^-1。咯菌腈是高效安全低毒的新型杀菌剂，通过抑制葡萄糖磷酰化有关的转移，抑制真菌菌丝体的生长，最终导致病菌死亡，其作用机理具有独特和持久性，且不会与其它杀菌剂产生互抗作用，可以与其它杀菌剂混合使用以达到更好的杀菌效果^[29-30]；戊唑醇、氟硅唑属于三唑类的杀菌剂，作用机理是影响甾醇类化合物的形成，破坏菌丝细胞膜、抑制病菌的附着胞和吸器的发育，阻碍菌丝和孢子的生长。多菌灵是高效低毒的内吸式杀菌剂，起到治疗和保护的作用^[31]。抑菌效果较差的是福美双、唑醚·代森联和啶酰菌胺，其中啶酰菌胺的EC₉₀=553 09.942 mg·L^-1。根据对小新壳梭孢的室内毒力测定，选择精甲·咯菌腈、戊唑醇、氟硅唑和多菌灵4种抑菌效果较好的杀菌剂进行室内盆栽药效试验，结果显示精甲·咯菌腈、戊唑醇和多菌灵在400 mg·L^-1处理下，保护作用较好，抑制率分别为92.43%、89.55%和92.94%。精甲·咯菌腈和戊唑醇在400 mg·L^-1处理下，治疗作用较好，抑制率分别为87.50%和82.09%。

通过对小新壳梭孢的生物学特性研究，掌握了樟树溃疡病病原菌的生存条件，室内毒力测定和药效试验明确了不同杀菌剂对病原菌的作用效果，并筛选出抑制病原菌较好的药剂，为樟树溃疡病田间防治提供了重要的理论基础。