日本茵芋(Skimmia japonica)属芸香科(Rutaceae)茵芋属(Skimmia)雌雄异株的常绿灌木^[1-3]，分布于日本、菲律宾、台湾等东亚国家和地区。日本茵芋株高可达1 m左右，生长慢，每年只抽1次梢，但适应性强，株形优美，全株散发芳香味，叶片椭圆形，叶色翠绿光亮，其花、果观赏价值极高，市场紧俏。雄株品种‘鲁贝拉’(Skimmia japonica ‘Rubella’)^[1-3]和雌株品种‘帕贝拉’(Skimmia japonica ‘Pabella’)是近年来从荷兰引进的杂交栽培品种，其圆锥型花序顶生，雄株初春红褐色花蕾、玲珑可爱，白色小花浓密、芳香，花期长达三四个月；雌株青绿色花蕾，白色小花，花果期正值元旦、春节期间，豌豆大圆球形的核果逐渐成熟，由淡绿色转为鲜红色，可持续至晚秋，极具观赏性，是适合庭院、宾馆、公寓摆放的高端观花、观果类花木，其切枝是插花的高级枝材。由于引种时间短，繁殖技术滞后，未见其扦插技术研究报道，仅见红星茵芋(Skimmia reevesiana)扦插技术研究^[4-6]，播种繁殖的雌雄株比率约为11.2:88.8^[7]，规模化育苗的商品率较低(雄株只开花不结果)，难以推广应用。开展日本茵芋雌雄株组培技术研究，以期解决优质种苗产业化，为确保适宜的雌雄株比率(4:1)及提高商品性提供技术支撑。国内开展过红星茵芋组培技术研究，但未见区分雌雄株, 也未见日本茵芋组培技术报道^[8-10]；国外，PONCHIA et al^[11]对日本茵芋雌雄株组培技术进行研究，未获得再生植株。

从荷兰引进的日本茵芋雄株品种‘鲁贝拉’和雌株品种‘帕贝拉’，经适应性栽培3 a的盆栽苗。

分别剪取‘鲁贝拉’和‘帕贝拉’(以下称雄株、雌株)当年生枝条，将枝条剪切成单芽茎段作为外植体。外植体用75%酒精消毒30 s，无菌水冲洗5次，再用40%商用漂白水(6.0%次氯酸钠)稀释液消毒10~12 min，最后用无菌水清洗5次以上，每次2 min。3种基本诱导培养基：MS、B5、3.0 g·L^-1花宝1号，各培养基均添加1.5 mg·L^-16-苄氨基腺嘌呤(6-benzylaminopurine，6-BA)，附加30 g·L^-1蔗糖，5.5 g·L^-1琼脂，pH值调制为5.8。花宝1号由美国花宝公司进口。每种培养基接种雌雄株各100个芽茎段，重复3次。培养40 d后统计诱导率。

诱导培养50 d，芽苗长1.0 cm，切取芽苗转接到增殖培养。以3.0 g·L^-1花宝1号为基本培养基，设置6-BA的5个质量浓度梯度(0、2.5、5.0、7.5、10.0 mg·L^-1)试验。以3.0 g·L^-1花宝1号+2.5 mg·L^-16-BA为培养基，设置芽苗切取方法与不同质量浓度赤霉素(gibberellin A₃，GA₃)的组合试验：切除芽苗顶芽+0 mg·L^-1GA₃、切除芽苗顶芽+1.0 mg·L^-1GA₃、切除芽苗顶芽+2.0 mg·L^-1GA₃、切除芽苗顶芽+4.0 mg·L^-1GA₃、保留芽苗顶芽+0 mg·L^-1GA₃、保留芽苗顶芽+1.0 mg·L^-1GA₃、保留芽苗顶芽+2.0 mg·L^-1GA₃、保留芽苗顶芽+4.0 mg·L^-1GA₃。每种培养基转接雌雄株继代丛生芽苗各30个单芽。转接60 d，统计各培养基雌雄株芽苗增殖倍率。以上培养基均附加30 g·L^-1蔗糖，5.5 g·L^-1琼脂，pH值均调制为5.8。

增殖培养50 d，选取叶片舒展、高1.0 cm以上的单株芽苗，转入生根培养。以1.5 g·L^-1花宝1号为基本培养基，设置不同质量浓度生根粉1号(root powder，ABT 1号)与萘乙酸(naphthylacetic acid，NAA)的组合试验：0.5 mg·L^-1ABT 1号、1.0 mg·L^-1ABT 1号、0.5 mg·L^-1NAA、1.0 mg·L^-1NAA、0.5 mg·L^-1ABT 1号+0.5 mg·L^-1NAA。每种培养基转接雌雄株单株芽苗各100株，重复3次。生根培养50 d，统计芽苗生根率及观察根系生长状况。以上培养基均附加15 g·L^-1蔗糖，5.5 g·L^-1琼脂，pH值为5.8。

生根瓶苗根长0.5 cm左右，即转入自然散射光条件较好的温室炼苗，苗高1.5 cm左右，即可移栽。移栽基质选用黄心土+椰糠(3:1)的混合基质，生根苗移栽后，基质上层覆盖一层苔藓层保湿。移栽苗床采用塑料薄膜和遮光率75%的遮荫网覆盖，保持拱棚内空气相对湿度85%、温度(24±4) ℃，直至小苗长出新叶，再逐渐打开遮荫网和薄膜。

培养室温度为(24±2) ℃，每天辅助光照14 h，光照强度950~1 900 lx。生根培养前7 d放置在培养室无直接光源处，生根培养15 d后应以自然散射光为辅助光源，光强约为3 000 lx。

诱导率/%=诱导出腋芽或不定芽的外植体数÷(接种外植体数－污染的外植体数)×100。增殖倍率=增殖培养后的芽苗总数÷接入的芽苗数(统计高0.5 cm以上的芽苗)。芽苗生根率/%=生根的芽苗数÷接入的芽苗数×100。数据采用SPSS软件分析，Tukey法多重比较。

日本茵芋雌雄株茎段在3种培养基上培养20 d左右，即可见茎段腋芽萌动，培养40 d，分别统计各培养基上雌雄株的诱导率(表 1)。3种培养基上雄株平均诱导率为31.0%，大大低于雌株的66.2%；雌雄株在3.0 g·L^-1花宝1号培养基上的诱导率较其它2种培养基高，分别为75.6%、34.7%。方差分析结果：F_培养基=14.22，大于F_0.01(2，6)=10.90；F_雌雄株=26.34，大于F_0.01(1，6)=13.70；2个因素的P值均为0.000 1，表明培养基及雌雄株系对诱导率的影响均达极显著水平。多重比较结果表明，花宝1号更适宜日本茵芋雌雄株的离体培养，可能与花宝1号中的N:P:K(7:6:19)比有关。

日本茵芋生长慢，离体培养的增殖及高生长均表现生长慢，因此增殖培养周期也较长。芽苗增殖培养50 d，仍可见大多芽苗没有增殖，仅见芽苗高生长。由表 2可见，雌株增殖倍率高于雄株，雄株在6-BA质量浓度为7.5 mg·L^-1时，增殖倍率最高，为1.35倍。雌株在6-BA质量浓度为0~7.5 mg·L^-1时，增殖倍率随6-BA质量浓度升高呈上升趋势；当6-BA质量浓度为7.5~10.0 mg·L^-1时，增殖倍率随6-BA质量浓度升高呈缓慢下降趋势；当6-BA质量浓度为5.0~7.5 mg·L^-1时，增殖倍率达2.28~2.32倍，但芽苗有明显的玻璃化, 因此后续试验6-BA质量浓度均采用2.5 mg·L^-1。方差分析结果：F_雌雄株=97.46，大于F_0.01(1, 22)=7.95；F_6-BA=4.24，大于F_0.05(2, 22)=3.44。表明雌雄株对增殖倍率达极显著影响，6-BA的质量浓度对增殖倍率影响显著。

芽苗切取方法和GA₃对增殖倍率的影响见表 3。添加4.0 mg·L^-1GA₃，结合切除芽苗顶芽，雌雄株均获得了较高的增殖倍率，分别为4.25和3.22倍。切除芽苗顶芽能较快促进芽苗从基部萌发新芽苗(图 1)，增殖倍率高于保留芽苗顶芽。方差分析结果：F_{芽苗切取方法}=61.48，大于F_0.01(1，10)=10.0；F_GA3=6.36，大于F_0.05(3，10)=3.71。表明芽苗处理方法对增殖倍率影响达极显著水平，GA₃对增殖倍率的影响达显著水平，说明在培养基中添加GA₃，结合切除芽苗顶芽，对提高增殖倍率效果显著。

	注：上排为切除芽苗顶芽；下排为保留芽苗顶芽。Note: removing the terminal buds of shoots in the upper-row culture bottles，and keeping the terminal buds in the lower-row culture bottles. 图 1 芽苗切取方法对增殖倍率的影响 Fig. 1 Effects of shoots cutting-way on proliferation rate
图选项

ABT、NAA对生根率的影响结果见表 4。日本茵芋雌雄株芽苗生根均较迟缓，生根培养15~20 d，芽苗基部萌发白色根芽眼。添加NAA的培养基上，芽苗基部愈伤组织较大，且发根迟，生根率也较低(图 2)。方差分析结果为：F_{生长调节剂组合}=30.79，大于F_0.01(3，17)=5.18；F_雌雄株=58.72，大于F_0.01(1，17)=8.4，表明生长调节剂组合及雌雄株对芽苗生根率的影响均达极显著水平。多重比较结果表明：1.5 g·L^-1花宝1号+0.5 mg·L^-1ABT 1号为最佳生根培养基，雌雄株生根率最高，分别为73%和61%，说明ABT 1号优于NAA，而低质量浓度ABT 1号又较高质量浓度ABT 1号，更适宜日本茵芋雌雄株生根培养。

	注：上排植株为1.0 mg·L-1NAA处理；下排植株为1.0 mg·L-1ABT 1号处理。Note: the upper-row plantlets were treatmented with 1.0 mg·L-1 NAA，and the lower-row plantlets were treatmented with 1.0 mg·L-1 ABT No.1. 图 2 芽苗生根情况 Fig. 2 Rooting situation of shoots
图选项

组培苗移栽在黄心土+椰糠(3:1)混合基质中，移栽50 d后，雌雄株组培苗移栽成活率分别为86%和83%。

日本茵芋较佳的诱导培养基为3.0 g·L^-1花宝1号+1.5 mg·L^-16-BA，雌雄株诱导率分别75.6%、34.7%。增殖培养阶段，在3.0 g·L^-1花宝1号+0~10.0 mg·L^-16-BA培养基上，雌雄株均未获得理想的增殖，其最大增殖倍率仅为2.32和1.35。PONCHIA et al^[11]通过添加苯基噻二唑脲(thidiazuron，TDZ)替代6-BA提高了雌株的增殖率。而本研究通过在培养基3.0 g·L^-1花宝1号+2.5 mg·L^-16-BA上添加4.0 mg·L^-1GA₃，结合切除芽苗顶芽的方法，提高了雌雄株的增殖倍率，其最高增殖倍率分别为4.25、3.22倍。生根培养阶段，ABT 1号较NAA更适宜生根培养，且低浓度ABT 1号(0.5 mg·L^-1)的生根率最高。PONCHIA et al^[11]认为低浓度的IBA(0.5 mg·L^-1)有利于日本茵芋雌株的生根培养。试验最佳生根培养基为1.5 g·L^-1花宝1号+0.5 mg·L^-1ABT 1号，雌雄株生根率分别为73%和61%。雌雄株组培苗移栽在黄心土+椰糠(3:1)基质中，成活率分别为86%和83%。PONCHIA et al^[11]的组培苗移栽试验中，未获得成活植株，并认为日本茵芋生根苗适应性较差。

日本茵芋雌雄株的诱导率、增殖率及生根率均达极显著差异，雄株的诱导率、增殖率及生根率均低于雌株。这与PONCHIA et al^[11]的研究结果较为相似，雌雄株离体培养表现的差异，可能与雌雄株基因型差异有关。日本茵芋是生长极为缓慢的常绿灌木，在自然状态下，1 a仅抽梢1次^[3]，其离体培养也表现出芽苗生长缓慢，增殖及生根培养周期长，增殖倍率及生根率较低等现象，可见日本茵芋符合离体培养顽拗型植物特性^[12]。闫国华等^[12]认为离体培养顽拗性是遗传预决定性生长，很难从外界环境与营养上调控。日本茵芋顶端优势极强，通过切除芽苗顶芽，及添加一定浓度的GA₃，只是一定程度上促进了芽苗增殖和伸长生长，提高增殖倍率。要满足日本茵芋雌雄株组培苗低成本、高效、规模化生产，还须进一步优化培养条件打破其离体培养顽拗性，提高增殖率及生根率等技术指标。