2019, Vol. 39
文章信息
- 孙红英, 辛全伟, 兰思仁
- SUN Hongying, XIN Quanwei, LAN Siren
- 珍珠彩桂的快速繁殖技术
- Study on rapid propagation technology of Osmanthus fragrans var. latifolius Makino subvar. Zhenzhu Caigui
- 森林与环境学报,2019, 39(3): 287-291.
- Journal of Forest and Environment,2019, 39(3): 287-291.
- http://dx.doi.org/10.13324/j.cnki.jfcf.2019.03.009
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文章历史
- 收稿日期: 2018-08-03
- 修回日期: 2018-10-09
2. 福建农林大学林学博士后科研流动站, 福建 福州 350002
2. Forestry Post-doctoral Station, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China
桂花[Osmanthus fragrans(Thunb.)Lour.]又名木犀，是木犀科(Oleaceae)木犀属(Osmanthus)植物，为传统的名贵香花，在我国已有2 000 a以上的栽培历史，既可观赏，又可食用，是绿化、美化、香化环境兼具的优良常绿园林树种和经济树种，在南方地区大量栽培，深受历代人民的喜爱[1-3]。珍珠彩桂(Osmanthus fragrans var. latifolius Makino subvar. Zhenzhu Caigui)是银桂(Osmanthus fragrans var. latifolius Makino)的变异品种，原产地台湾，后被引种到大陆。其叶片可以随着季节的变化而不断变换颜色，初春嫩芽为紫红色，后转为暗红，进而转为桔黄、浅桔黄、黄白色、珍珠白，接近成熟的叶片为灰绿色，成熟叶片则变为绿色，极具观赏价值和市场推广前景[4]。至今，有关桂花组织培养已有大量研究[5-6]，但针对珍珠彩桂组培的研究还未见报道。本研究通过珍珠彩桂外植体消毒、启动培养、增殖培养、生根培养、炼苗移栽的研究，建立珍珠彩桂高效组培快繁体系，为优质种苗的培育提供技术支撑。
1 材料与方法 1.1 试验材料供试材料来源于广西桂林荔浦新林桂花苗木场。从健壮、无病虫害、生长良好的母株上选取芽点饱满、1年生、半木质化的枝条作为外植体材料，保湿处理带回组培室。
1.2 试验方法 1.2.1 外植体消毒将枝条切成0.5~1.5 cm，去掉叶片和叶柄，在流水中冲洗30 min，用柔软的牙刷清洗外植体表面，在2%的NaClO溶液中浸泡2 min，再用75%的酒精处理35、50 s两个梯度，最后用0.1%的HgCl2消毒5、8和11 min，无菌水冲洗4~5遍后用无菌滤纸吸去外植体表面的水分，装入无菌瓶中备用。每个消毒处理3次重复，各85个茎段，共接种1 530个茎段。比较不同消毒时间的灭菌效果，30 d后统计污染率和成活率。培养条件：温度(25±3) ℃, 光照时间12 h·d-1，光照强度3 500 lx。以下均同。
1.2.2 启动培养采用以下6种培养基进行启动培养：(1)木本植物培养基(woody plant medium, WPM) +1.0 mg·L-16-苄氨基腺嘌呤(6-benzylaminopurine，6-BA)+0.1 mg·L-1赤霉素(gibberellin A3，GA3)；(2) WPM+2.0 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1GA3；(3)WPM+3.0 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1GA3；(4)WPM+1.0 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1GA3；(5)WPM+2.0 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1GA3；(6)WPM+3.0 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1GA3。以上各培养基均添加30 g·L-1蔗糖和6.5 g·L-1琼脂，pH值为5.8。每瓶接种1个外植体，每个处理50瓶。观察腋芽的生长情况，25 d后，统计启动率。
1.2.3 增殖培养采用L9 (34)正交试验设计(表 1)。接种25 d后统计增殖系数。
| 水平 Level |
因素Factor | ||
| 6-BA | KT | GA3 | |
| 1 | 3.0 | 1.0 | 0.1 |
| 2 | 4.0 | 2.0 | 0.3 |
| 3 | 5.0 | 3.0 | 0.5 |
| 注：KT为6-糖基氨基嘌呤。Note: KT is kinetin. | |||
将株高2 cm左右，带有2对以上叶片的无根壮苗，转接到以1/2WPM为基本培养基，并分别添加0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 mg· L-13-吲哚丁酸(3-indolebutyric acid, IBA)的生根培养基上。每种培养基接种20瓶，每瓶5株，进行生根培养，30 d后统计生根率。
1.2.5 炼苗移栽将组培室培养30 d后的生根苗放到自然环境条件下，放置3~5 d, 拧开组培瓶瓶盖，放置2 d，定时进行叶片喷水保湿，保证叶片伸展无卷叶、焦叶，促使组培苗适应自然环境条件。将组培苗从瓶中取出，在自来水中洗掉培养基，放到5‰的高锰酸钾溶液中消毒5 min，最后，用自来水清洗干净，移栽到珍珠岩:蛭石:泥炭土体积比为1:1:1的基质中，定时喷淋，30 d后统计移栽成活率。
1.3 数据处理与分析外植体污染率/%=污染个数/接种个数×100；成活率/%=成活个数/接种个数×100；启动率/%=茎段萌芽数/接种后无菌茎段总数×100；增殖系数/%=诱导后不定芽总数/原接种茎段总数×100；生根率/%=生根个数/接种个数×100；移栽成活率/%=存活苗数/移栽苗数×100。试验数据采用SPSS 16.0和Excel软件进行统计分析。
2 结果与分析 2.1 外植体消毒珍珠彩桂外植体消毒采用75%的酒精和0.1%HgCl2组合处理，随着消毒时间的延长，污染率逐渐下降(表 2)。当0.1%HgCl2灭菌时间5 min时，处理1和处理4的污染率均高于20%。使用75%的酒精消毒35 s或50 s、0.1%HgCl2消毒8 min，污染率分别是16%和17%，成活率是68.3%和73.3%，这两个处理污染率较低，成活率较高，且这两个处理间无显著差异，都可以作为珍珠彩桂外植体消毒的方法。珍珠彩桂最佳的消毒处理方法为：流水中冲洗30 min→2%NaClO溶液中浸泡2 min→无菌水冲洗3遍→75%的酒精处理35 s或50 s→无菌水冲洗3遍→0.1%的HgCl2消毒8 min→无菌水冲洗4~5遍→无菌滤纸吸去外植体表面的水分。
| 处理编号 Treatment number |
处理方法 Treatment |
接种数 Inoculation number |
污染率 Contamination rate/% |
成活率 Survival rate/% |
| 1 | 75%酒精35 s+0.1%HgCl2 5 min 75% Ethanol 35 s+0.1%HgCl2 5 min |
85 | 25±4.0a | 61.3±3.2b |
| 2 | 75%酒精35 s+0.1%HgCl2 8 min 75% Ethanol 35 s+0.1%HgCl2 8 min |
85 | 16±2.0bc | 68.3±4.9ab |
| 3 | 75%酒精35 s+0.1%HgCl2 11 min 75% Ethanol 35 s+0.1%HgCl2 11 min |
85 | 19±2.6abc | 62.0±2.6b |
| 4 | 75%酒精50 s+0.1%HgCl2 5 min 75% Ethanol 50 s+0.1%HgCl2 5 min |
85 | 23±2.6ab | 64.0±6.1ab |
| 5 | 75%酒精50 s+0.1%HgCl2 8 min 75% Ethanol 50 s+0.1%HgCl2 8 min |
85 | 17±2.0bc | 73.3±1.5a |
| 6 | 75%酒精50 s+0.1%HgC12 11 min 75%Ethanol 50 s+0.1%HgC12 11 min |
85 | 14±3.6c | 63.0±2.6ab |
| 注：表中污染率和成活率为平均值±标准差；同列数据后不同字母表示差异达0.05显著水平。Note:contamination rate and survival rate are the mean±standard deviation; different letters indicate difference of 0.05 significant level. | ||||
不同培养基类型对珍珠彩桂外植体启动率的影响见表 3。培养基中添加1.0 mg ·L-1 6-BA，虽然对珍珠彩桂有启动效果，但启动率较低，芽生长较慢，长势弱。当培养基中添加3.0 mg· L-1 6-BA时，芽虽然生长较快，但叶片生长不正常，且基部生长较大的愈伤组织较大。培养基中添加2.0 mg·L-16-BA和0.1 mg·L-1 GA3，虽有较高的启动率，但茎段较细，长势一般。因此，根据芽的生长状况筛选出最佳的腋芽诱导培养基为WPM+2.0 mg· L-16-BA+0.5 mg· L-1GA3+6.5 g· L-1琼脂+30 g·L-1蔗糖，启动率为86.4%, 珍珠彩叶桂外植体在此培养基上芽生长较快，叶片伸展，浓绿，腋芽较粗。
| 处理编号 Number of treatment |
6-BA质量 浓度6-BA concentration /(mg·L-1) |
GA3质量 浓度GA3 concentration /(mg·L-1) |
接种后无菌外植体数 Number of sterile explants |
萌芽数 Number of germination |
启动率 Initiation rate/% |
启动情况 Initiation situation |
| 1 | 1.0 | 0.1 | 38 | 11 | 28.9 | 芽生长较慢，叶片泛黄，长势较弱The buds grow slowly and the leaves are yellow and weak |
| 2 | 2.0 | 0.1 | 42 | 32 | 76.2 | 芽生长快，茎段细，长势一般The buds grow fast, the stem section is fine, and grows as usual |
| 3 | 3.0 | 0.1 | 34 | 25 | 73.5 | 芽生长较快，基部愈伤组织较大，叶片卷曲The buds grow faster, the callus at the base is larger, and the leaves are curled |
| 4 | 1.0 | 0.5 | 39 | 15 | 38.5 | 芽生长慢，茎段较细，长势弱The buds grow slowly and the stem section is fine and weak |
| 5 | 2.0 | 0.5 | 44 | 37 | 86.4 | 芽生长快，叶片伸展，浓绿，腋芽较粗The buds grow fast, the leaves extends, and are thick green; axillary buds are thicker |
| 6 | 3.0 | 0.5 | 33 | 23 | 69.7 | 芽生长较快，基部愈伤组织较大，新芽水渍状，出现玻璃化The buds grow faster, the callus at the base is larger; the new buds are water stained and vitrified |
不同激素对珍珠彩桂增殖的影响见表 4。不同激素对珍珠彩桂的增殖都有较大影响，3种激素对增殖作用由大到小的顺序为：6-BA>KT>GA3。6-BA在珍珠彩桂的继代培养中作用最大，其R值为2.7。6-BA的3个浓度梯度的K值分别为2.1、4.8和3.8。可见，珍珠彩桂的增殖系数并不是随着6-BA的增加而增加。不同处理都有不同程度的增殖，其增殖系数最大的是5号培养基，增殖系数为5.8。珍珠彩桂增殖最佳培养基为：WPM+4.0 mg· L-16-BA+2.0 mg ·L-1KT+0.5 mg· L-1 GA3+6.5 g· L-1琼脂+30 g· L-1蔗糖。
| 处理编号 Number of treatment |
6-BA质量浓度 6-BA concentration /(mg·L-1) |
KT质量浓度 KT concentration /(mg·L-1) |
GA3质量浓度 GA3 concentration /(mg·L-1) |
增殖系数 Proliferation coefficient |
| 1 | 3.0 | 1.0 | 0.1 | 1.5 |
| 2 | 3.0 | 2.0 | 0.3 | 2.1 |
| 3 | 3.0 | 3.0 | 0.5 | 2.7 |
| 4 | 4.0 | 1.0 | 0.3 | 3.9 |
| 5 | 4.0 | 2.0 | 0.5 | 5.8 |
| 6 | 4.0 | 3.0 | 0.1 | 4.6 |
| 7 | 5.0 | 1.0 | 0.5 | 3.7 |
| 8 | 5.0 | 2.0 | 0.1 | 4.2 |
| 9 | 5.0 | 3.0 | 0.3 | 3.5 |
| K1 | 2.1 | 3.0 | 3.4 | |
| K2 | 4.8 | 4.0 | 3.2 | |
| K3 | 3.8 | 3.6 | 4.1 | |
| R | 2.7 | 1.0 | 0.9 |
从方差分析(表 5)中可看出，在珍珠彩桂继代过程中，6-BA对增殖系数影响最大(F=307.562)，在0.01水平达到显著；其次为KT(F=42.437)，在0.05水平达到显著；再次为GA3(F=36.062)，在0.05水平显著。结果与极差分析一致。
| 变异来源 Sources of variation |
平方和 Sum of square |
自由度 Degree of freedom |
均方 Mean square |
F值 F value |
P值 P value |
| 6-BA | 10.936 | 2 | 5.468 | 307.562 | 0.003 |
| KT | 1.509 | 2 | 0.754 | 42.437 | 0.023 |
| GA3 | 1.282 | 2 | 0.641 | 36.062 | 0.027 |
| 误差 | 0.036 | 2 | 0.018 | ||
| 总和 | 13.762 | 8 |
将继代培养1个周期(25 d), 高度为2 cm左右的单株接种到添加有不同质量浓度IBA的生根培养基中。10 d左右根基部凸起，根原基形成，15 d从根原基上长出嫩根，30 d根长至3 cm左右。从表 6可以看出，当IBA质量浓度为1.0~3.0 mg· L-1时，随着IBA质量浓度的升高，平均根长逐渐升高，平均根数逐渐增加。当IBA质量浓度为3.0~4.0 mg ·L-1时，平均根长、平均根数和生根率逐渐下降，而当IBA质量浓度为3.0 mg ·L-1时，生根较快，根系较粗，生根时间短，生根率较高。当生根培养基为1/2WPM+3.0 mg ·L-1IBA，生根率达89.5%。
| IBA质量浓度 IBA concentration /(mg·L-1) |
平均根长 Average length of root/cm |
平均根数 Average number of roots |
生根率 Rooting rate/% |
生长状况 Growth status |
| 1.0 | 1.32±0.14d | 1.52±0.31c | 32.5±7.10d | 生长慢，根细长，根部无愈伤组织形成Slow growth, slender roots, no callus formation in the root |
| 2.0 | 1.85±0.48cd | 2.23±0.38bc | 44.6±11.48cd | 生长慢，根细长，生根时间长，形成颗粒状愈伤组织Slow growth, slender roots, long rooting time, granular callus formed |
| 2.5 | 2.24±0.12bc | 3.36±0.21a | 61.3±9.70bc | 生长慢，根变粗，生根时间长，根部皮层愈伤组织凸起Slow growth, roots thickening, long rooting time, root cortex callus bulged |
| 3.0 | 3.15±0.13a | 3.78±0.14a | 89.5±6.21a | 生长快，根变粗，生根时间短，根原基凸起Fast growth, roots thickening, short rooting time, root primordium raised |
| 3.5 | 2.81±0.10ab | 3.12±0.35ab | 77.4±11.25ab | 生长快，根粗壮，根短，根部愈伤组织较大Fast growth, strong roots, short rooting and large callus |
| 4.0 | 2.46±0.04b | 2.85±0.56ab | 65.2±13.55abc | 生长快，根粗壮，生根短，根部表面爆裂，愈伤组织大Fast growth, strong roots, short roots, root surface burst, large callus |
| 注：表中数据为平均值±标准差；同列数据后不同字母表示差异达0.05显著水平。Note: data in the table is the mean±standard deviation; different letters indicate difference of 0.05 significant level. | ||||
移栽30 d后，统计珍珠彩桂组培苗的成活率，成活率达到90%以上。移栽50 d，珍珠彩桂组培苗叶片舒展变大，叶片深绿色，顶芽有新叶长出。
3 讨论与结论木本植物组织培养首先要确保所有材料无菌状态，常用外植体消毒剂有次氯酸钠、乙醇、过氧化乙酸、苯酚、升汞等[7]。在珍珠彩桂消毒过程中，使用75%酒精和0.1%升汞处理外植体达到较好的消毒效果，最终优选出珍珠彩桂外植体消毒方式为：流水中冲洗30 min→2%的NaClO溶液中浸泡2 min→无菌水冲洗3遍→75%的酒精处理35 s或50 s→无菌水冲洗3遍→0.1%的HgCl2消毒8 min→无菌水冲洗4~5遍→无菌滤纸吸去外植体表面的水分。75%酒精和0.1%升汞处理组合，随着消毒时间的增加外植体成活率增加，达到最优消毒处理组合后，随着时间的增加，成活率呈下降趋势，经分析，0.1%升汞在消毒过程中消毒时间较长时会毒害外植体，导致成活率下降。王莹等[8]在不同消毒剂不同浓度激素对鹿耳草外植体诱导研究的研究中也有类似的报道。
继代增殖是组织培养的关键，找到适合的增殖培养基配方才能达到组培快繁的目的[9]。在珍珠彩桂继代培养过程中，6-BA、KT和GA3对珍珠彩桂组培苗均有显著影响，但6-BA增殖作用最大，在一定范围内，随着使用浓度增加增殖系数在逐渐升高，当达到一定浓度时，随着6-BA浓度增加增殖系数逐渐降低，与姜傲芳等[10]对薜荔组织培养的研究结果一致。最终筛选出最适珍珠彩桂增殖的培养基为：WPM+4.0 mg· L-16-BA+2.0 mg ·L-1KT+0.5 mg· L-1 GA3+6.5 g· L-1琼脂+30 g· L-1蔗糖，增殖系数为5.8。
在植物快速繁殖中，培养基中添加一定质量浓度的生长素有利于诱导生根[11]。在生根培养过程中发现，随着IBA的使用浓度的增加，平均根长和平均生根率均随之增加，但达到一定浓度范围，继续增加IBA的使用浓度，反而平均根长和平均生根率均随之下降，这与激素的两重性作用相一致，低浓度促进生根，高浓度抑制生根。最终筛选出珍珠彩桂最佳的生根培养基为1/2WPM+3.0 mg ·L-1IBA，生根率可达89.5%。
WPM广泛用于木本植物离体培养，其无机盐总含量远低于MS培养基，WPM中N的含量仅相当于1/4MS，而K的含量略低于3/4MS，Ca、P和Mg的含量与MS相同[12]。本研究使用WPM培养基不仅获得了珍珠彩桂组培苗较高的增殖系数且得到了较高的生根率，因此，WPM是适合珍珠彩桂组培快繁的基本培养基。综上所述，本研究成功建立了珍珠彩桂成熟的快繁体系，较高的增值系数、生根率、移栽成活率可以降低组培生产成本，为珍珠彩桂工厂化快速育苗提供了理论基础和技术支撑，为当前珍珠彩桂供不应求的市场提供了一条快速繁殖的技术体系，具有重要的现实意义。
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