椰心叶甲[Brontispa longissima (Gestro)]隶属鞘翅目(Coleoptera)铁甲科(Hispidae)潜甲亚科(Anisoderinae)平胸族(Cryptonychini) ^[1-3]，起源于印度尼西亚和巴布亚新几内亚，是严重危害棕榈科植物的入侵生物^[4-5]。该虫危害棕榈科植物的25属约34种，其中椰子树(Cocos nucifera L.)是最主要寄主^[6-7]。其以成虫和幼虫在未展开心叶中取食危害，植物受害后，轻则导致树势减弱，重则植物心部逐渐腐烂，直至整株枯死^[8-10]，是我国林业危险性有害生物之一。

细菌与真菌是昆虫自然死亡的重要生物因子。金龟子绿僵菌[Metarhizium anisopliae (Metschnikoff)](以下简称绿僵菌)是重要的昆虫病原真菌之一，能寄生200多种昆虫、螨类和线虫^[11]。病原细菌能在昆虫体内增殖，产生有害的物质，造成昆虫代谢紊乱，最终致死^[12]。两者对寄主昆虫致病机理的不同，产生其对同一寄主的致病速度的差异，一般细菌对昆虫的致病速度较快。为了探讨细菌与绿僵菌混配，昆虫感染细菌后是否有利真菌进一步侵染，从而提高其对椰心叶甲的致病力，本研究通过致病力测定，评价病原细菌与绿僵菌混配菌液对椰心叶甲的致病力，并通过测定细菌挥发物和发酵液对绿僵菌孢子萌发、菌丝生长和产孢量的影响，研究其混配的相容性，为利用病原微生物防治椰心叶甲提供一定的理论依据。

1 材料与方法 1.1 供试菌株

选择对椰心叶甲有较强致病力的细菌Ba-z菌株和金龟子绿僵菌Ma1775菌株^[13-14]，以单剂及其混配液进行致病力测定。用3株分离自椰心叶甲幼虫的细菌，测定其挥发物和发酵液对绿僵菌生长的影响，3株细菌分别为：Ba-r菌株为沙雷氏菌 (Serratia marcescens sp.)，Ba-s菌株和Ba-z菌株为Alcaligene faecalis ssp. phenolicus^[13]。金龟子绿僵菌Ma1775分离自松墨天牛(Monochamus alternatus Hope)幼虫。

1.2 供试虫

供试椰心叶甲采自福建省厦门市老人葵(Washingtonia filifera Wendl.)寄主上，采回的成虫和幼虫放入食品保鲜盒(18 cm×10 cm×6 cm)中，以老人葵心叶饲养，每3 d更换一次新鲜的心叶。

1.3 培养基

NA固体培养基(牛肉膏3 g，NaCl 5 g，蛋白胨10 g，琼脂20 g，加水至1 000 mL，pH值自然)；NA液体培养基(牛肉膏3 g，NaCl 5 g，蛋白胨10 g，加水至1 000 mL，pH值自然)；水琼脂培养基(琼脂8 g，加水至1 000 mL，pH值自然)；PPDA斜面(去皮马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，蛋白胨20 g，加水至1 000 mL，pH值自然)。

1.4 细菌与绿僵菌对椰心叶甲的致病力测定 1.4.1 细菌悬液的制备

将细菌接种于NA斜面上活化2 d后，用无菌水冲洗斜面至三角瓶中，置于SHA-C恒温振荡器上27 ℃，150 r · min^-1充分震荡10 min。采用平板菌落计数法计数，将待测菌液稀释10、100、1 000倍等若干倍液，各取2 μL稀释菌液涂布于NA平板上，培养24 h后，各平板上形成肉眼可见的菌落，统计菌落数。选取肉眼可见10~30个菌落的平板，以该平板菌落数乘以该平板菌液稀释倍数为该待测菌液浓度。将细菌悬液根据需要配成不同浓度备用。

1.4.2 绿僵菌孢悬液的制备

待菌株在PPDA斜面培养基上充分产孢后，用含0.05% Tween-80的无菌水洗下孢子，置于振荡器上，150 r · min^-1充分震荡10 min，血球计数板计数，根据需要配成不同浓度的孢悬液备用。

1.4.3 致病力测定

配制3种菌液，菌液A浓度为(1±0.5) ×10⁷孢子· mL^-1的绿僵菌Ma1775孢悬液；菌液B浓度为(1±0.5) ×10¹² cfu · mL^-1的细菌Ba-z悬液；菌液C为菌液A和菌液B的混配液(V:V=6:94) ^[15]。由于椰心叶甲低龄幼虫发育历期短，在28 ℃条件下，椰心叶甲2龄和3龄幼虫发育历期均在4 d左右^[16-17]，为了尽可能避免幼虫蜕皮而影响绿僵菌的侵染效果，将供试虫椰心叶甲分为：成虫、5龄幼虫、4龄幼虫和2~3龄幼虫。分别将试虫放入食品保鲜盒，每盒30头，以老人葵心叶饲养。以喷菌法接菌，把心叶打开，分别将菌液A、菌液B和菌液C均匀喷于试虫虫体和老人葵心叶上，每盒喷菌2 mL，以喷洒等量无菌水为对照。喷完后置于27 ℃，相对湿度95%的MODEL SPX-250C型人工气候箱内饲养。每天观察、记录死虫数，持续观察10 d，观察过程中，若发现有脱皮或脱皮后进入下一虫龄的幼虫，按原龄期幼虫统计。以镊子轻碰虫体，并放培养皿2 min不动的视为死亡，并及时将死虫挑入无菌培养皿，以浸无菌水的脱脂棉保湿，ZDP-A2050型恒温培养箱27 ℃培养，以观察有效致死情况。每个虫龄、每种菌液为1个处理，每个处理5个重复，每个重复30头试虫。

1.5 细菌与绿僵菌的相容性 1.5.1 细菌发酵液与绿僵菌孢悬液的制备

细菌接种于NA液体培养基，于恒温振荡器上27 ℃，150 r · min^-1充分震荡10 min，再置于恒温培养箱培养2 d。将培养好的菌液加入到50 mL离心管(内径r=14 mm)中，8 000 r · min^-1，离心5 min，取上清液即发酵液，保存备用。绿僵菌孢悬液的制备方法同1.4.2。

1.5.2 细菌挥发物对绿僵菌Ma1775孢子萌发率的影响

无菌操作下，取10 mL细菌发酵液加入到无菌培养皿中，用大小相同的水琼脂培养基平板反扣其上，封口膜封住，使挥发物吸附于水琼脂培养基上。以水琼脂培养基平板反扣装有等量的NA液体培养基为对照。27 ℃恒温培养箱中培养2、4、7 d后，无菌操作下取下水琼脂培养基平板，取2 μL绿僵菌Ma1775孢悬液涂布，27 ℃恒温培养，每24 h定时检测孢子萌发率，每平板随机观测3次，每次观测视野内孢子总数不少于200个，以孢子芽管长度超过孢子宽度的一半记为萌发。每种细菌发酵液、每个吸附天数为1个处理，每个处理5个重复，每个重复1个培养皿。

$ 孢子萌发率/{\rm{\% = }}\frac{{{\rm{萌发的孢子数}}}}{{{\rm{观察的总孢子数}}}} \times 100 $

(1)

1.5.3 细菌挥发物对绿僵菌Ma1775菌落生长和产孢量的影响

在无菌操作下，用移液枪吸取2 μL绿僵菌Ma1775孢悬液，滴加到PPDA平板培养基中央，反扣到盛有10 mL细菌发酵液的培养皿上，封口膜封住。以反扣到盛有10 mL NA液体培养基的培养皿上为对照。然后置于27 ℃恒温培养箱培养。分别于第2、4、6、8、10 d以十字交叉法定时测量菌落直径。每种细菌发酵液为1个处理，每个处理5个重复，每个重复1个培养皿。3株菌株培养15 d后，用打孔器(d=4 mm)在菌落中心和边缘约1/2处以“梅花型”打孔，放入装有100 mL 0.05% Tween-80无菌水的三角瓶中，置于摇床130 r · min^-1震荡20 min，血球计数板计数，并计算菌落单位面积产孢量。每株细菌挥发物为1个处理，每个处理5个重复，每个重复1个培养皿，每个培养皿打6个孔。产孢量(个孢子· mm^-2)计算公式：

$ {\rm{产孢量 = }}\frac{{{\rm{孢子浓度}} \times {\rm{100}}}}{{6{\rm{ \mathsf{ π} }} \times {{\rm{2}}^{\rm{2}}}}} $

(2)

1.5.4 细菌发酵液对绿僵菌Ma1775孢子萌发率的影响

取冷却到室温的水琼脂培养基49、48、47、46、45 mL，分别向其加入1、2、3、4、5 mL细菌发酵液，配制成含细菌发酵液2%、4%、6%、8%、10%的混配菌液，倒平板，每皿10 mL。以不加细菌发酵液的等量水琼脂培养基为对照。待培养基凝固后，用移液枪吸取2 μL绿僵菌Ma1775孢悬液，滴加到平板中央，涂布，27 ℃恒温培养。每种细菌发酵液、每个浓度为1个处理，每个处理5个重复，每个重复1个培养皿。观察方法同1.5.2。

1.5.5 细僵菌发酵液对绿僵菌Ma1775菌落生长和产孢量的影响

以含2%、4%、6%、8%、10%细菌发酵液的PPDA培养基倒平板。待培养基凝固后，用移液枪吸取2 μL绿僵菌Ma1775孢悬液，滴加到PPDA平板中央，封口膜封住，以不加细菌发酵液的PPDA培养基为对照，置于27 ℃恒温培养箱培养。每种细菌发酵液为1个处理，每个处理5个重复，每个重复1个培养皿。菌落直径和产孢量测定方法同1.5.3。

1.6 数据分析

试验所得数据用Excel 2016处理。各死亡率经反正弦平方根转换后，进行单因素方差分析和Duncan′s新复极差法多重比较。用SPSS 22.0计算致死中时(LT₅₀)和致死中浓度(LC₅₀) ^[10]，并采用死亡率-时间几率值法，以时间的对数值为x₁，校正死亡率的几率值为y₁，计算得出各菌株的LT₅₀的线性回归方程。致病力计算如公式(3) ~ (5)。

$ 死亡率 /{\rm{\% = }}\frac{{{\rm{死亡虫数量}}}}{{{\rm{供试虫数量}}}} \times 100 $

(3)

$ 校正死亡率/{\rm{\% = }}\frac{{{\rm{处理死亡率－对照死亡率}}}}{{{\rm{100－对照死亡率}}}} \times 100 $

(4)

$ 僵虫率/{\rm{\% = }}\frac{{{\rm{僵虫数量}}}}{{{\rm{供试虫数量}}}} \times 100 $

(5)

2 结果与分析 2.1 细菌与绿僵菌对椰心叶甲的毒力

统计分析各处理对椰心叶甲的致死效果，并做线性回归分析，结果见表 1。从表 1可知，对2~3龄的低龄幼虫，含有细菌Ba-z单剂和混配菌液处理的死亡率极显著高于对照和绿僵菌单剂处理(P < 0.01，df=3，F=776.71)，且致死速度更快，致死中时(LT₅₀)为4 d左右。而对高龄幼虫和成虫，绿僵菌单剂处理的死亡率均极显著高于混配菌液处理(P < 0.01，df=3，高龄幼虫和成虫的F值分别为129.93和294.89)，且致死速度更快；混配菌液处理的死亡率极显著高于细菌单剂处理。说明，细菌Ba-z对低龄幼虫致死效果较好，绿僵菌对高龄幼虫与成虫致死效果较好，两者混配，细菌对绿僵菌侵染椰心叶甲没有促进作用。

2.2 细菌挥发物对绿僵菌孢子萌发的影响

3株细菌挥发物对绿僵菌孢子萌发的影响结果见表 2。从表 2可知，培养基吸附细菌的挥发物后，绿僵菌Ma1775孢子萌发率呈极显著下降(P < 0.01，df=3，96 h处理时间下，Ba-r、Ba-z和Ba-s的F值分别为4 047.26、20 356.05和6 865.41)，并随着培养基吸附挥发物处理时间的延长，以及细菌浓度的增加，绿僵菌孢子萌发率呈明显下降趋势。说明，细菌挥发物对绿僵菌孢子萌发有较强的抑制作用。

2.3 细菌挥发物对绿僵菌生长和产孢量的影响

细菌挥发物对绿僵菌菌落生长直径、产孢量的影响结果见表 3。从表 3可知，在有吸附细菌挥发物的培养基上，各时段绿僵菌Ma1775的菌落直径均极显著低于对照。说明，3株细菌的挥发物对绿僵菌菌丝生长、产孢量均有较强抑制作用。

2.4 细菌发酵液对绿僵菌孢子萌发的影响

3株细菌发酵液对绿僵菌孢子萌发的影响结果见表 4。从表 4可知，培养基加入细菌发酵液后，在48 h前，绿僵菌Ma1775孢子萌发率极显著低于对照(P < 0.01，df=5，Ba-r、Ba-z和Ba-s的F值分别为278.99、690.91和796.05)，恒温培养72 h，混配菌液中细菌Ba-z发酵液含量较低的绿僵菌Ma1775孢子萌发率与对照无显著差异，其它处理的孢子萌发率均极显著低于对照(P < 0.01，df=5，Ba-r、Ba-z和Ba-s的F值分别为7.45、8.59和8.08)，并随着培养基中细菌发酵液浓度的增大，绿僵菌孢子萌发率呈明显下降趋势，绿僵菌孢子萌发率直至96 h差异较小。可见，细菌发酵液前期对绿僵菌的孢子萌发有较强的抑制作用。

2.5 细菌发酵液对绿僵菌生长和产孢量的影响

不同浓度的细菌发酵液对绿僵菌Ma1775的孢子萌发率和产孢量的影响结果见表 5，由表 5可知，各时间段均体现出，3株细菌的发酵液浓度越高，绿僵菌Ma1775菌落直径越小。第2天，含细菌发酵液较高浓度(8%以上)的绿僵菌Ma1775菌落直径均极显著低于对照(P < 0.01，df=5，Ba-r、Ba-z和Ba-s的F值分别为5.47、5.45和9.65)。第4天，各处理绿僵菌Ma1775的菌落直径均极显著低于对照(P < 0.01，df=5，Ba-r、Ba-z和Ba-s的F值分别为11.39、5.90和9.19)，第6天后，含细菌发酵液(6%以上)的绿僵菌Ma1775菌落直径显著低于对照(P < 0.05，df=5，Ba-r、Ba-z和Ba-s的F值分别为2.19、2.26和3.13)。绿僵菌Ma1775充分产孢后，其产孢量极显著低于对照，含细菌发酵液浓度越高，产孢量越少。说明，3株细菌的发酵液对绿僵菌菌丝生长、产孢量也有较强抑制作用。

3 讨论与结论

细菌主要通过取食或伤口感染寄主昆虫，其在昆虫体内快速增殖，产生有害物质，造成昆虫代谢紊乱，最终致死寄主昆虫，绿僵菌对昆虫的致病机理与其完全不同^[18]，所以绿僵菌对昆虫的致死速度相对较慢。本研究利用细菌Ba-z和绿僵菌Ma1775单剂及其混配剂，测定其对椰心叶甲的致病力，结果发现，除了2~3龄的低龄幼虫，椰心叶甲校正死亡率表现为：绿僵菌Ma1775单剂>混配菌液>细菌单剂，且细菌含量越高，校正死亡率越低。说明，致病速度较快的细菌，不一定有利于绿僵菌进一步侵染昆虫，这为真菌与细菌混配对昆虫的致病机理研究奠定了基础，为应用病原微生物防治害虫提供了一定的理论依据。

致病力测定发现，混配菌液中病原细菌Ba-z含量越高，椰心叶甲高龄幼虫和成虫的死亡率越低。利用3株病原细菌，测定其挥发物和发酵液与绿僵菌的相容性，证实了3株细菌挥发物与发酵液对绿僵菌绿僵菌Ma1775的孢子萌发、菌丝生长和产孢量均有较强的抑制作用。绿僵菌侵染寄主昆虫过程中，分生孢子萌发是其成功侵染的关键。前人研究表明，细菌可以合成抗菌物质、杀虫蛋白、抗肿瘤物质和胞外酶等化合物，对昆虫病原真菌的孢子和菌丝产生抑制。杨雪云等^[19]研究发现，松材线虫[Bursaphelenchus xylophilus (Steiner & Buhere)Nickle]携带的两株荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens Migula) GcM5-1A、ZM4A和恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida) ZpB1-2A的挥发性代谢产物能抑制真菌菌丝的生长。杨秀芬等^[20]研究发现嗜线虫致病杆菌发酵液对植物病原真菌有抑制作用。在细菌和真菌混配液中加入适量的乳化剂，可以减少细菌对真菌的抑制，Tween-80是一种良好的乳化剂^{[15, 19-22]}。

另外，对于2~3龄的椰心叶甲低龄幼虫，病原细菌Ba-z含量越高，死亡率越高，且致死速度越快，分析其主要原因可能为：首先，同剂量的细菌，对低龄幼虫的致病作用强于个体较大、免疫力相对较强的高龄幼虫和成虫；其次，与细菌、绿僵菌的致病机理不同以及低龄幼虫发育历期短有关，椰心叶甲2~3龄幼虫发育历期较短，在28 ℃条件下，椰心叶甲2龄和3龄幼虫发育历期均在4 d左右，而4龄幼虫6 d，5龄近9 d，成虫的发育历期更长^[16-17]，因此，低龄幼虫脱皮不利于绿僵菌侵染，曹伟平等^[23]认为，幼虫的蜕皮机制对虫生真菌(白僵菌)感染幼虫有一定的抵御作用。