椰心叶甲[Brontispa longissima (Gestro)]属鞘翅目 (Coleoptera) 铁甲科 (Hispidae) 潜甲亚科 (Anisoderinae)，是全国重要检疫性害虫^[1]。1999年以来，在广东、广西、海南等地入境的棕榈科植物均有检测到该虫，并以一定速度向周边地区蔓延^[2]。该虫主要危害棕榈科植物25属约34种，其中以椰子为最主要寄主^[3]。椰心叶甲幼虫和成虫均聚集在棕榈科植物的未展开心叶中取食危害。植物受害后，被取食叶片呈现明显的与叶脉平行的褐色病斑，轻则树势减弱，引起次期性害虫进一步危害，重则植物心部逐渐腐烂，无新叶抽出，直至整株枯死^{[1, 4]}。

绿僵菌[Metarhizium anisopliae (Metschnikoff)]是昆虫主要病原真菌之一，能寄生鞘翅目^[5]、鳞翅目^[6]、同翅目^[7]等200余种昆虫，对螨类^[8]也有一定的致病性，其在害虫生物防治中被广泛应用。本研究通过致病力试验，评价分离自椰心叶甲成虫的2株金龟子绿僵菌和松墨天牛幼虫的3株金龟子绿僵菌对椰心叶甲各龄虫态的致病力，为该害虫的生物防治提供菌种资源。

供试菌株中，绿僵菌Maxm-07菌株和绿僵菌Maxm-05菌株均分离自椰心叶甲成虫，其它3株绿僵菌菌株分离自松墨天牛幼虫，各菌株信息见表 1。

供试椰心叶甲采自福建省厦门市老人葵植株上。采回的成虫和幼虫放入透明塑料盒 (18 cm×10 cm×6 cm) 中，以老人葵心叶饲养，每3 d更换一次心叶。

待各菌株在PPDA斜面培养基 (去皮马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，蛋白胨20 g，加水至1 000 mL) 上充分产孢后，用含0.05% Tween-80的无菌水冲洗孢子，于SHA-C恒温振荡器上150 r·min^-1充分震荡10 min，血球计数板计数，配成各种浓度的孢子悬液。

(1) 成虫接菌 选择饲养3 d的健康成虫，每个广口瓶 (D=9 cm，H=10 cm) 装30头试虫。采用喷菌法接菌，在距广口瓶底部12 cm处，以浓度 (1±0.5)×10⁷孢子·mL^-1孢子悬液垂直喷洒5下。并在广口瓶底放血球计数板，以同样的方法模拟接菌，统计单位面积的接菌量。接菌后，以新鲜老人葵心叶4~5片 (L=5~6 cm) 饲养，以浸有灭菌水的脱脂棉保湿。于温度27 ℃，相对湿度95%人工气候箱内饲养，每3 d更换一次心叶。每天观察、统计各处理椰心叶甲死亡数。以镊子触碰试虫，其触角或足不动，且放置干燥、安静环境5 min仍未活动的试虫为死亡。将死虫移至无菌的培养皿内，垫上滤纸，并用浸有灭菌水的脱脂棉保湿，于27 ℃的人工气候箱中培养，观察死尸表面菌丝生长和产孢情况。僵虫判断标准参照童应华等^[5]方法，以虫体上长出可见菌丝或孢子为有效致死。每个虫龄、每株菌株为1个处理，每个处理5个重复，每个重复30头成虫。以喷等量含0.05% Tween-80的无菌水为对照。

(2) 幼虫接菌 选择饲养3 d的健康幼虫作为供试虫。参照周荣等^[9]的方法，依据体长和头壳宽度，将幼虫分为3个阶段：2~3龄幼虫 (体长2.62~5.09 mm，头宽0.53~0.91 mm)、4龄幼虫 (体长5.89~6.19 mm，头宽1.15~1.19 mm)、5龄幼虫 (体长7.61~7.85 mm，头宽1.30~1.32 mm)。以 (1±0.5)×10⁷孢子·mL^-1孢子悬液喷菌法接菌。将试虫用毛笔挑入培养皿 (D=11 cm)，每培养皿30头试虫，用喷菌器在其正上方12 cm处，垂直喷洒5下，待虫体表面干燥后，以新鲜老人葵心叶6~7片 (L=7~8 cm) 饲养，脱脂棉浸灭菌水保湿。温、湿度条件和饲养方法，以及观察、死虫处理和统计方法同1.3.2中的成虫接菌。每个虫龄阶段、每株菌株为1个处理，每个处理5个重复，每个重复30头幼虫。以喷等量含0.05% Tween-80的无菌水为对照。

根据死亡率、僵虫率和致死中时 (LT₅₀)，选择致病力较强的菌株，分别以浓度为 (1±0.5)×10⁴、(1±0.5)×10⁵、(1±0.5)×10⁶、(1±0.5)×10⁷、(1±0.5)×10⁸孢子·mL^-1的孢子悬液接菌，成虫和幼虫的接菌及接菌后饲养、观察和统计方法分别同1.3.2中的成虫接菌和幼虫接菌。每个虫龄、每个浓度为1个处理，每个处理5个重复，每个重复30头试虫。以喷等量含0.05% Tween-80的无菌水为对照。

用SPSS 22.0计算LT₅₀和致死中浓度 (LC₅₀)^[10]，采用死亡率-时间几率值法，以时间的对数值为x₁，校正死亡率的几率值为y₁，计算各菌株的LT₅₀的线性回归方程; 以浓度的对数值为x₂，校正死亡率的几率值为y₂，计算得出各菌株的LC₅₀的线性回归方程。用邓肯氏新复极差法对各处理的死亡率和僵虫率进行多重比较。时间-剂量-死亡率 (time-dose-mortality，TDM) 模型采用DPS 7.05进行处理分析^[11-12]，并评价各处理的致死效应。致病力计算公式如式 (1)~(3)。

成虫接菌2 d后取食量开始减少，行动减缓，足部附着力减弱。死虫经恒温保湿培养2~3 d后，各体节节间及腹部未端有白色菌丝产生; 4~5 d后，头、胸、腹节间及腹部未端有大量深绿色孢子产生。幼虫接菌2 d后，取食量未见明显变化，但部分爬行能力明显减弱，刚感染死亡的虫体，有的有少量点状白色菌丝，经恒温保湿培养2~3 d后，白色菌丝逐渐覆盖虫体，4~5 d后虫体上覆盖大量深绿色孢子，有的还有深褐色的液状分泌物，腹部未端的钳状尾突部位没有孢子。

以浓度 (1±0.5)×10⁷孢子·mL^-1的孢子悬液喷菌，各菌株对椰心叶甲均有一定致病力，且存在较大差异。试验观察发现，成虫15 d后全部死亡，幼虫14 d后全部死亡。取处理后10 d的死亡数量做累计死亡率动态图，结果见图 1。接菌后3~6 d，各龄虫的死亡率上升速度较快。其中Ma1775菌株对各龄虫态的致死速度均较快，累计死亡率也较高，致病力效果较好。

	图 1 不同处理椰心叶甲累计死亡率 Fig. 1 Cumulative mortality of B. longissima after different treatment
图选项

各菌株接菌后10 d的死亡情况见表 2。绿僵菌Ma1775菌株对椰心叶甲各虫龄阶段校正死亡率和僵虫率均高于其它菌株, LT₅₀最短，其次为Maxm-05菌株。各线性回归方程相关系数均高于0.9，拟合程度高，表明所求方程合适。接菌后第10天，Ma1775菌株处理的椰心叶甲各虫龄校正死亡率均较高，除了与Maxm-05菌株处理无显著差异外，均显著高于其它菌株处理。成虫校正死亡率达 (67.96±3.66)%，5龄幼虫校正死亡率达 (78.53±2.73)%，4龄幼虫校正死亡率达 (82.59±2.48)%，2~3龄幼虫校正死亡率达 (73.46±4.60)%。各菌株对各年龄段椰心叶甲的致病力强弱顺序为4龄幼虫＞5龄幼虫＞2~3龄幼虫＞成虫。结果显示，2~3龄幼虫死亡率较低，这可能与2~3龄幼虫龄期较短及蜕皮有关^[13]。

进一步测定绿僵菌Ma1775菌株对椰心叶甲各虫龄3、6、10 d的致死中浓度 (LC₅₀)，结果见表 3。根据所得数据计算出Ma1775菌株各浓度下线性回归方程及相关系数。各方程拟合相关系数值均高于0.9，所求方程合适。通过计算，第6天成虫的LC₅₀为3.52×10⁸孢子·mL^-1，5龄幼虫LC₅₀为7.13×10⁷孢子·mL^-1，4龄幼虫LC₅₀为2.48×10⁷孢子·mL^-1，2~3龄幼虫LC₅₀为7.69×10⁷孢子·mL^-1。

表 4为绿僵菌Ma1775菌株对椰心叶甲致病力的时间-剂量-死亡率模型参数估计值。经Pearson Chi-Squar拟合度检验，成虫χ²=15.848＜χ_0.05²(39)=54.572，P=0.999 78；5龄幼虫χ²=14.000＜χ_0.05²(39)=54.572，P=0.999 90；4龄幼虫χ²=9.929＜χ_0.05²(39)=54.572，P=0.999 90；2~3龄幼虫χ²=14.208＜χ_0.05²(39)=54.572，P=0.999 90。所有试虫组统计值均小于显著性水平α=0.05的临界值，可认为模型拟合中不存在显著异质性，拟合成功。孢子悬液对各龄阶段虫的剂量效应参数β分别为3.555 6、3.779 4、3.842 1和4.021 7，表明该菌株各浓度的孢子悬液对该虫均有一定的致死效果。总体上，接菌处理的时间效应参数γ_i在接菌2 d后开始上升，说明该虫在接菌后2 d开始死亡，并且死亡数不断增加。而成虫在接菌后3~6 d，γ_i较前后变化较大，间接表明该时间段成虫死亡数较多。可见，绿僵菌Ma1775对椰心叶甲成虫的致死效应较强的时间段在接菌后3~6 d。同样可知，该菌株对椰心叶甲各龄期幼虫的致死效应较强的时间段均在接菌后3~7 d。随着时间的推移其累计死亡率模型的时间效应参数逐渐增大，符合真菌对昆虫的致病特点^[14]。

试验发现，5株绿僵菌菌株对椰心叶甲均有一定的致病力，其对椰心叶甲各虫态的致病力强弱为4龄幼虫＞5龄幼虫＞2~3龄幼虫＞成虫。绿僵菌Ma1775菌株的致病力最强，分离自椰心叶甲成虫的Maxm-05次之，而另一分离自椰心叶甲成虫的Maxm-07菌株致病力较弱。因此，Ma1775和Maxm-05菌株有较大的应用潜力，并且林间防治时，可选择在该虫幼虫4~5龄阶段时进行防治。

椰心叶甲1龄幼虫虫体很小，发育历期短，且喷菌后自然死亡率很高，所以本试验剔除了1龄幼虫。试验过程中发现，喷菌后幼虫还有继续蜕皮现象，尤其是2~3龄幼虫，蜕皮较明显。曹伟平等^[13]认为，幼虫的蜕皮机制对虫生真菌感染幼虫有一定的抵御作用。椰心叶甲低龄幼虫3~4 d即可完成一次蜕皮，这可能是2~3龄幼虫死亡率较低于4~5龄幼虫的主要原因。

有关绿僵菌对椰心叶甲的致病力，前人做了相关研究。王九辉^[15]研究发现，绿僵菌MA3对椰心叶甲成虫及各龄幼虫均具有较好的致病效果，以浓度1×10⁷孢子·mL^-1的孢子悬液接菌9 d后，成虫校正死亡率达 (72.27±6.24)%，与本研究结果相近；丁福章^[16]分别将浓度为5×10⁸、1×10⁸、5×10⁷和1×10⁷孢子·mL^-1绿僵菌油剂点滴于椰心叶甲成虫前胸背板处 (0.1 μL·头^-1)，供试成虫30头，其7 d校正死亡数分别为7.76、6.33、3.33和2头，感染率较低。张雯龙等^[17]用8株绿僵菌菌株进行室内毒力试验表明，SY-2菌株效果最好，以浓度1×10⁸孢子·mL^-1的孢子悬液接菌10 d后，3龄幼虫校正死亡率为96.70%，LT₅₀为3.8 d；成虫校正死亡率为85.03%，LT₅₀为5.4 d，同时认为，绿僵菌防治有较好的市场前景，但是优良菌株获得有限，因此分离不同地区和不同寄主上的优良菌株是提高生物防治效果的关键。