土壤酸化是全球性环境问题之一。近年来, 全世界范围内酸雨发生、酸性化肥分解、微生物代谢以及植物根系吸收阴阳离子不平衡等诸多因素相结合加剧了土壤酸化进程, 酸性土壤的面积进一步扩大^[1]。TONG et al^[2]结果表明，土壤酸化加剧了植物的铝毒害。杉木[Cunninghamia lanceolata (Lamb.) Hook.]是我国南方特有树种, 目前, 杉木林种植面积为1.1×10⁷ hm², 总蓄积量达到7.3×10⁸ m³, 分别占乔木林总面积的6.7%及总蓄积量4.9%^[3-4]。杉木分布区土壤主要为富铁铝化酸性土壤, 土壤中铝常常以有毒害作用的活性铝形式如Al³⁺、Al (OH)²⁺、Al (OH)₂⁺存在, 其通过影响杉木对水分与养分的吸收与利用, 从而导致杉木林生产力下降^[5]。因此, 如何缓解杉木林的铝毒害, 提高酸性土壤杉木人工林地的生产力是目前我国林业工作者亟待解决的难题之一。

养分对铝毒具有缓解效应。钙作为植物生命活动中所必需的矿质元素和重要信号分子, 对缓解植物铝毒有相当大的作用^[6]。研究表明, 铝胁迫下, 钙不仅能降低细胞可溶性糖含量, 增强细胞抗氧化酶活性, 而且能竞争性地与根部铝结合位点结合, 影响植物对铝的吸收与代谢, 从而提高植物的耐铝能力^[7-8]。国内外关于钙缓解植物铝毒害的研究主要侧重在农作物上, 而对杉木的研究较少；张帆等^[9]侧重研究不同钙铝摩尔比对杉木幼苗丙二醛 (malondialdehyde，MDA) 含量和过氧化物酶 (peroxidase，POD) 的影响, 而对其他的生理指标却缺乏较为系统的研究。鉴于此, 本文以1年生杉木幼苗为材料, 较为系统地分析铝钙复合作用对杉木幼苗抗氧化能力的影响, 探讨钙对杉木幼苗铝毒害的缓解机制, 从而为受铝毒损害的杉木人工林生态系统的修复奠定理论基础。

1 材料与方法 1.1 材料

试验用的1年生杉木实生苗为福建省尤溪国有林场3代种子园种子繁育的同一批长势一致的同一家系幼苗。基础培养液为Hoagland营养液^[5]。

1.2 试验设计

铝浓度设计为0、0.5、1.0和1.5 mmol·L^-1；钙浓度分别为0、1.5、3.0和4.5 mmol·L^-1。铝、钙浓度梯度水平设计见表 1。培养过程在福建农林大学田间实验室试验大棚内进行。杉木幼苗根部依次经清水冲洗、0.5% NaClO溶液消毒及超纯水漂冲后放入完全营养液培养7 d，再进行苗木驯化。培养容器为四周涂成黑色的塑料桶 (V=4.5 L)。驯化期结束后, 各处理分别换成对应的胁迫溶液继续培养。每个处理4个重复, 每桶培养4株幼苗，共32桶。胁迫0 d, 第8天, 第16天, 第24天分别取同一部位鲜叶样品, 于4 ℃温度下保存, 用于后续生理指标的测定。每天早晨6：00, 中午12：00及傍晚18：00各通气一次, 每次15 min。

1.3 MDA含量和抗氧化酶活性的测定

分别称取0.5 g各处理待测干净杉木幼苗叶片, 放于研钵中。加入5 mL浓度为0.05 mol·L^-1, pH值为7.0的磷酸钠缓冲液 (PBS)、0.1 g聚乙烯毗咯烷酮 (PVP)、10 μL β-巯基乙醇，在冰浴中研磨至匀浆后转移至离心管中, 于4 ℃, 15 000 r·min^-1离心15 min, 吸取上清液定容至15 mL即为酶液，并于4 ℃保存以备用，以下各项生理指标测定均用此酶液。

MDA含量测定按赵世杰等的方法, 吸取酶液1 mL, 加入10%三氯乙酸3 mL和0.6%TBA溶液2 mL, 在沸水浴上反应15 min, 迅速置于冰浴中冷却后, 4 000 r·min^-1离心10 min。最后在532、600、450 nm波长下测定上清液的吸光度值。SOD活性采用氮兰四唑法^[11]测定, 对照管加入0.1 mL pH值为7.8的PBS, 混匀后将对照管放于暗处, 其余各处理置于日光灯下反应15 min, 然后立即置于暗处终止反应。分别测定各管在560 nm波长处的吸光度值。CAT活性采用紫外吸收法^[12]测定, 向10 mL试管中加入待测酶液0.2 mL, pH值为7.8、浓度为0.05 mol·L^-1的PBS 1.5 mL，蒸馏水1 mL。25 ℃预热5 min后加入2%H₂O₂ 0.3 mL, 在240 nm波长下测定反应液的吸光度值。POD活性采用愈创木酚法^[13]测定, 反应体系包括：2%H₂O₂ 1 mL，0.05 mol·L^-1愈创木酚1 mL，0.05 mol·L^-1、pH值为5.5的PBS 2.9 mL及0.1 mL酶液。37 ℃水浴保温15 min后迅速放到冰浴中，在470 nm波长下测定反应液的吸光度值。

1.4 数据处理

方差分析及最小差异显著性检验采用SPSS处理, 采用Excel软件制图。

2 结果与分析 2.1 高铝不同钙浓度对幼苗叶片MDA含量的影响

由图 1可见, 随着铝胁迫时间的延长, 各个处理的杉木幼苗叶片MDA含量总体上呈上升趋势；尤以无钙处理下变化最为明显, 与胁迫0 d相比, 胁迫8，16，24 d时, MDA含量分别上升了62.96%、92.59%、119.75%。而在同等胁迫时间下, 高钙处理后，MDA含量变化却较小, 上升幅度仅为5.00%、12.50%、17.50%。在相同胁迫时间下, 随着钙离子浓度上升, 杉木幼苗叶片MDA含量呈逐渐下降趋势。在胁迫8，16，24 d时, 高钙处理与无钙处理相比, MDA含量分别低了57.96%、80.05%、102.25%。结果表明, 高铝不同胁迫时间和不同钙浓度水平对杉木幼苗叶片MDA含量存在极其显著的影响，两因素间交互作用呈极其显著水平，这表明钙可以明显抑制铝胁迫引起的杉木幼苗叶片MDA含量上升。

2.2 高铝不同钙浓度对幼苗叶片抗氧化酶活性的影响

如图 2所示, 随着胁迫时间的增加, 杉木幼苗叶片SOD活性总体上呈现下降趋势。其中, 无钙处理下，SOD活性变化幅度最大。与胁迫0 d相比, 无钙处理在胁迫8，16，24 d时, 杉木幼苗叶片SOD活性分别下降了24.38%、36.32%、44.28%。而在高钙处理下, SOD活性随胁迫时间变化下降幅度很小, 在胁迫8 d时先稍微升高1.20%, 接着分别下降4.41%、6.81%。从相同胁迫时间角度来看, 随着钙离子浓度升高, 杉木幼苗叶片SOD活性总体呈上升趋势。在胁迫8, 16, 24 d时, 高钙处理与无钙处理相比, SOD活性分别高了21.18%、33.91%、37.47%。

2.3 高钙不同铝浓度对幼苗叶片MDA含量的影响

由图 3可见, 随着胁迫时间的延长, 各个处理的叶片MDA含量总体上呈现略微的上升趋势, 但这种变化不明显。与胁迫0 d相比, 在胁迫8, 16, 24 d时, 高钙无铝处理, MDA含量分别只上升了1.23%、0.00%、3.70%。而在高铝高钙处理下，MDA含量分别也只上升了5.00%、12.50%、17.50%。总体来说, 各处理MDA含量变化幅度很小。在胁迫16, 24 d时, 随着铝离子浓度上升, MDA含量总体呈逐渐上升趋势, 高钙处理与无钙处理相比, MDA含量分别提高了12.50%、14.20%。而在胁迫8 d时, MDA含量在各处理间几乎没有变化。结果显示, 高钙不同胁迫时间和不同铝浓度水平对杉木幼苗叶片MDA含量的影响均达到极显著水平。

随着铝胁迫时间的延长, 各处理杉木幼苗叶片CAT活性总体上也表现降低趋势, 变化趋势类似于SOD活性的变化。CAT活性也在无钙处理情况下变化幅度最大。与胁迫0 d相比, 无钙处理下在胁迫8, 16, 24 d时, CAT活性分别下降了25.90%、45.45%、53.00%。而在高钙处理下, CAT活性先上升后下降, 且下降幅度最小。从相同胁迫时间来看, 随着钙离子浓度升高, CAT活性也呈总体增加趋势。在胁迫8, 16, 24 d时, 高钙处理与无钙处理相比CAT活性分别高了24.73%、40.42%、46.00%。

随着胁迫时间的延长, 各处理杉木幼苗叶片POD活性的变化没有SOD和CAT明显, 但总体上也呈现下降趋势, 不过这种变化幅度很小。与胁迫0 d相比, 变化相对明显的无钙处理, 在胁迫8, 16, 24 d时, POD活性分别下降了10.65%、16.62%、19.48%。同样在高钙处理下, POD活性也呈先上升后下降。从相同胁迫时间来看, 随着钙离子浓度升高, POD活性也呈总体增加趋势。在胁迫8, 16, 24 d时, 高钙处理与无钙处理相比, POD活性分别高了7.51%、15.83%、16.60%。结果表明, 高铝不同胁迫时间和不同钙浓度水平对杉木幼苗叶片SOD、CAT和POD活性的影响均达到极其显著水平。

2.4 高钙不同铝浓度对幼苗叶片抗氧化酶活性的影响

如图 4所示, 随着胁迫时间的延长, 各处理叶片SOD活性表现为先上升后下降趋势。高铝处理的SOD活性变化最大, 与胁迫0 d相比, 胁迫8, 16, 24 d时, 其SOD活性先上升1.20%, 接着分别下降了4.41%、6.81%。从相同胁迫时间来看, 随着铝离子浓度升高, SOD活性呈总体下降趋势。在胁迫8, 16, 24 d时, 高钙处理与无钙处理相比, SOD活性分别低了5.52%、8.62%和8.09%。

随着胁迫时间的延长, 各处理的叶片CAT活性大体上变化为先上升后下降。高铝处理的CAT活性变化最大, 与胁迫0 d相比, 胁迫8, 16, 24 d时, CAT活性先上升1.17%, 接着分别下降了5.03%、7.00%。从相同胁迫时间来看, 随着铝离子浓度升高, CAT活性变化不显著。

随着胁迫时间的延长, 各处理的叶片POD活性总体上也呈现先上升后下降趋势, 变化幅度基本一致。与胁迫0 d相比, 胁迫8, 16, 24 d时, 高铝处理的POD活性先上升3.14%、0.79%, 接着下降了2.88%。从相同胁迫时间来看, 随着铝离子浓度升高, POD活性与CAT活性相似，变化不显著。结果表明，高钙不同胁迫时间和不同铝浓度水平对杉木幼苗叶片SOD、CAT和POD活性的影响均达到极显著水平。

3 讨论

铝毒害不仅影响植物的形态和细胞结构, 还影响植物的代谢水平, 特别是MDA含量及一些抗氧化酶的活性。当植物体受到铝胁迫时, 植物代谢过程中会产生活性氧自由基威胁植物体的生命, 而SOD、CAT和POD等抗氧化物酶可以清除这些活性氧自由基，有效缓解铝毒对植物的伤害^[14]。许多研究表明, 在铝胁迫条件下, 植物抗氧化酶活性发生变化, 从而产生适应逆境胁迫的反应, 同时, 铝浓度的变化对植物体内酶活性的表型形式会产生不同影响^[15-16]。本试验发现, 在同一钙浓度处理下，随着铝浓度的增加, 杉木幼苗叶片SOD, CAT和POD活性发生了显著的变化, 说明铝可以对杉木幼苗产生毒害。

众多研究表明, 养分具有缓解铝毒害的作用, 如钙、镁、磷等矿质元素能明显降低铝对植物的毒害效应。其中, 钙离子作为植物生命活动所必需的矿质元素, 是植物细胞壁的组成成分及代谢调节中的第二信使, 对缓解铝毒害有相当大的作用^[17]。CHIBILITI et al ^[18]在奈马格桃幼苗溶液培养试验中发现, 钙可以减少桃枝梢中铝的积累, 从而减轻高质量浓度铝 (50 mg·L^-1) 对桃幼苗的毒性。毛俊娟等^[19]研究表明, 钙浓度的增加能够缓解铝对麻疯树幼苗的毒害。蔡妙珍等^[20]实验结果表明, 铝胁迫条件下, 钙能显著提高荞麦叶中叶绿素含量, 促进根系的伸长, 。何龙飞等^[17]研究发现, 钙浓度的增加可显著缓解铝对小麦根系伸长的抑制作用。这些研究都说明了钙对铝毒有缓解作用。关于钙对铝毒缓解机制, LI et al^[21]研究发现, 调节细胞质中钙的体内平衡可以减少酵母菌中铝的毒害作用。定量RT-PCR分析表明在铝胁迫下, 钙离子信号通道中的钙调素 (CaM) 和磷脂酶C (PLC) 的表达都被下调；当抗细胞凋亡因子Ced-9超表达或提前用BAPTA-AM进行前处理时, 这种效应被大部分抵消掉。铝引起的细胞质中钙信号的消极调节可能是一种潜在的内部抵抗铝毒害的新机制^[21]。

在南方的酸性土壤中, 钟宁等^[22]研究南方6种土壤的铝含量的动态变化结果表明, 土壤pH值从5.68降低到4.40后, 土壤交换性铝的浓度从1.01 cmol·kg^-1上升到5.48 mol·kg^-1。张志祥等^[23]测定了浙江九龙山国家级自然保护区5种不同群落类型的钙浓度，其值在6.83~9.98 cmol·kg^-1。据以上数据粗略算出在酸性土壤中，钙铝摩尔浓度比在1.24~1.82, 这说明我国南方植物已受铝毒的危害。在今后的林业生产实践过程中，在施肥环节应增加钙肥的比例，从而减轻铝毒的伤害。