遗传多样性是生物多样性的核心内容，植物遗传多样性的存在是其作为一个有活力的进化单位能够长期适应不断变化的生态环境的根本保障^[1]。开展植物群体遗传多样性水平和结构的研究对于濒危植物种质的保护及可开发资源的有效利用都是非常重要的^[2]。杉木[Cunninghamia lanceolata(Lamb.)Hook.]是中国南方最重要的速生用材树种之一，在中国南方17个省区广泛分布，面积占全国人工林总面积的21.35%^[3]。长期以来，不同地理分布区的杉木受气候变化、异花授粉、地理隔离等因素的影响，其外部形态、材质材性等累积了大量的遗传变异，形成了形态各异，生理特性分化较大的不同地理类型^[4]。俞新妥^[5]1957年率先开始杉木产地试验，营造了许多不同种源的杉木试验林，筛选出了适合不同产区生长的杉木种源。

近年来，随着杉木人工林造林面积不断增大，许多天然杉木林遭到破坏，使得大量野生杉木种质资源逐渐消失；长期以来不同产区之间的杉木种源相互调拨，也造成了各地杉木人工林种子来源不清，由此导致杉木种质资源管理混乱。同时，由于全国不同时期营造的杉木种源试验林遭到不同程度的破坏，现在要找到来源清楚的杉木种源已相当困难^[6]。杉木生长寿命长 ，素有“万木之王”的美称，由于长期以来对杉木大径材的过渡砍伐，现存的天然的、树龄百年以上的杉木十分少见。福建是中国杉木的重要产区，杉木栽培历史悠久 ，目前分布有不少古老的“杉木王”资源^[4]。俞新妥^[5]将杉木王定义为胸径、树高和单株材积分别在1 m、30 m、10 m³以上，或是3个指标中至少2个满足的杉木。

杉木王种质来源清楚，其经受了长期的自然选择，记录了气候历史的变迁，是极其珍贵的遗传资源和育种材料，如何保护这些天然杉木林种质资源显得极为迫切^[7]。进行不同杉木王种质资源的收集和遗传多样性分析，对于分析全国杉木产区的分布范围和杉木种群的分布格局具有重要现实意义。为此，通过对福建省杉木王种质资源数量、生长和分布情况的全面调查，采用简单序列重复区间扩增多态性(inter-simple sequence repeats,ISSR)分子标记对杉木王种质资源遗传多样性进行研究，比较不同杉木王种质资源的遗传多样性差异，为杉木王遗传资源的保护和良种繁育提供依据。

根据俞新妥等^[4]的前期研究资料和各县市的实地调查结果，2011年收集44份福建杉木王种质资源。采用GPS仪记录杉木王分布的经纬度和海拔，把采集到的杉木王新鲜幼芽放入低温保存箱，带回实验室后于-80 ℃保存，用于DNA的提取。

采用UNIQ-10植物基因组DNA抽提试剂盒(上海生工生物工程有限公司)提取叶片基因组DNA，用Epoch^TM微孔板分光光度计(BioTek,Winooski,VT)测定DNA质量和浓度，并使用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测DNA条带的完整性。

对通过UBC primer set 9的100条ISSR引物进行筛选，共筛选出29条扩增条带清晰且多态性高的引物，并把其用于杉木王样本的聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增(表 2)。所用引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

采用PTC-200梯度PCR仪(Bio-Rad,Hercules,USA)进行DNA扩增反应。20 μL的PCR反应体系内含40 ng的基因组DNA，0.4 mmol·L^-1引物，1.5 mmol·L^-1 MgCl₂，0.3 mmol·L^-1 dNTPs和1.5 U的Taq DNA聚合酶。PCR扩增程序是94 ℃预变性7 min；94 ℃变性30 s，在各引物退火温度下退火40 s，72 ℃延伸2 min，共45个循环；72 ℃延伸7 min。PCR产物采用l×TBE电泳缓冲液，在含有0.1％溴化乙锭1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳分离。使用伯乐Gel Doc XR凝胶成像系统(Bio-Rad,Hercules,USA)观察凝胶并记录电泳条带的有无，根据条带的有无将电泳结果记录为1或者0，以二维数据矩阵的形式将电泳结果输入软件进行统计分析。

使用POPGENE version 1.32软件统计杉木王各群体观测等位基因数(observed number of alleles，Na)、有效等位基因数(effective number of alleles，Ne)、Nei′s基因多样性指数(Nei′s gene diversity index，h)和Shannon信息指数(Shannon′s information index，I)^{[8, 9]}。 采用NTSYS-pc version 2.11软件计算各样本间简单匹配遗传相似系数(simple match coefficient,SM)，并以非加权类平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means,UPGMA)进行聚类分析，构建各样本的树状聚类图^[10]。参照EVANNO et al^[11]的方法，依次设定类群数(K)为2-10，采用STRUCTURE2.3.4软件分析杉木王种群的遗传结构。根据公式ÄΔK=|L″(K)|/s[L(K)]b计算每个K值所对应的ΔK值，其中L(K)为每个K值对应的lnP(D)的平均值，L′(K)=L(K)-L(K-1)，|L″(K)|=|L′(K+1)-L′(K)| ，s[L(K)]为L(K)的标准差，ΔK值最大时所对应的K值即为所求杉木王亚群数^[12]。

目前，福建的杉木王有44株(表 1)，主要分布在闽西、闽南和闽北地区，闽东地区分布较少。本次调查的杉木王树龄都在百年以上，均被列为福建古树名木，并由政府挂牌保护。从分布海拔来看，杉木王主要位于海拔600-1 000 m，海拔最低的位于延平区王台镇溪后村，为153 m；海拔最高的位于连城县曲溪乡罗胜村水日，为1 251 m。从所属产区来看，分布在闽北杉木中心产区的有5株，占11.4%，一般产区34株，占77.2%，闽东南边缘产区5株，占11.4%。从现有福建杉木王的分布看，杉木一般产区的杉木王数量最多，闽西北中心产区和闽东南边缘产区内杉木王的数量较少。其原因可能是历史上福建杉木中心产区范围要比近代广，这与俞新妥^[13]的调查研究结果一致。

29条ISSR引物从44株福建杉木王种质基因组DNA中扩增出237条带，平均每条引物扩增8.17条带；引物BC879扩增的条带最多，为16条；引物BC835扩增的条带最少，为3条。BC810、BC820等13条引物所扩增的条带都具有多态性，而引物BC880扩增的条带多态性最弱，只有40%。ISSR标记扩增出的237个条带中多态性条带总共有212条，占总条带数的89%，表明福建杉木王多态性丰富，具有较高的遗传多样性。

POPGENE version 1.32软件统计分析表明，福建一般产区的杉木王遗传多样性最高(h=0.341 2,I=0.495 0)，中心产区和边缘产区的杉木王遗传多样性较低，二者多样性差异不大(表 3)。整体水平上，ISSR标记对44份福建省杉木王种质扩增的观测等位基因数为1.885 9，有效等位基因数为1.606 6，Nei′s基因多样性指数为0.342 8，Shannon信息指数为0.502 6，显示出较高的遗传多样性。

根据EVANNO et al^[11]的方法计算每个K值对应的ΔK值。结果表明，最大的ΔK出现在K=5，说明可将这44份杉木王种质划分为5个类群；划分的结果以5种不同的颜色体现，每种颜色代表 1个类群(图 1)。NTSYS 2.11软件构建的44份杉木王种质间UPGMA系统聚类树也表明，在相似系数阀值为0.69时，可将44份杉木王种质划分为5个类群，划分结果与各样本的遗传结构基本一致。其中，样本1(沙县郑湖乡长村)、样本3(明溪县枫溪乡邓家村)和样本29(宁化县河龙乡明珠村)的系统聚类结果和遗传结构类群划分结果并不一致，显示其较为杂合的遗传组成。类群I包括中心产区的沙县、永安、明溪、延平4地的杉木王和一般产区尤溪、宁化县济村乡2地的杉木王，共6个样本。类群Ⅱ由一般产区的13份种质组成。 类群Ⅲ由边缘产区安溪县长坑乡的2份种质和一般产区的新罗、漳平、上杭县的4份种质组成，共6个样本。类群Ⅳ由中心产区的建瓯杉木王和一般产区的闽清、永泰、德化、永春4地的杉木王种质组成，共11个样本。类群V由一般产区的宁化县水茜乡、宁化县河龙乡、武夷山、蕉城、屏南的5份种质和边缘产区安溪县龙涓乡、祥华乡的3份种质组成，共8个样本。总体看来，44份杉木王种质的类群划分结果与样本间的地理位置分布较为一致，同一或相近地理来源的样本大多聚在一起。

	图 1 44份杉木王样本的系统聚类树和遗传结构图 Figure 1 Clustering trees and genetic structures of 44 Chinese fir genetypes
图选项

福建省杉木王种质资源ISSR标记结果表明，29条ISSR引物共扩增出237条带，212条带具有多态性，占总条带数的89%。这一结果与彭珠清等^[14]对福建野生杉木资源的ISSR标记扩增结果近似，且略高于安静等^[15]对全国不同地理种源杉木ISSR标记的扩增结果，表明福建杉木王有丰富的遗传多态性。ISSR标记显示，福建省杉木王种质Nei′s基因多样性指数为0.342 8，Shannon信息指数为0.502 6。杨玉玲等^[16]对24个不同地理种源的杉木进行ISSR标记，显示其群体Nei′s基因多样性指数为0.215 4，Shannon信息指数为0.345 8；安静等^[17]对108个不同地理种源杉木进行ISSR标记，显示其群体Nei′s基因多样性为0.231 4，Shannon信息指数为0.357 5，均弱于本研究结果。郝博博^[18]对全国40个种源地183个样本的ISSR标记显示，其群体Shannon信息指数为0.565 5，略高于本研究的结果。因此，福建省杉木王资源具有相对较高的遗传多样性，育种潜力较大。

44份杉木王种质的UPGMA系统聚类分析和遗传结构分析均显示，福建杉木王可划分为5个类群，其类群划分结果与样本间的地理位置分布较为一致。这一结果与前人研究相似，即不同地理种源杉木的遗传类群划分结果与地理居群基本一致^{[17, 18, 19]}。杉木王经受了长期的自然选择，记录了气候历史的变迁，形成了适应当地气候、土壤条件的特殊地理生态类型和遗传变异，具有很强的物种稳定性和生态学适应性，是极其珍贵的遗传资源和育种材料^[4]。杉木王还融进了南方各地的民族风俗 ，被许多当地居民奉为“神树”，是历史的见证与文化的记录，对杉木王种质资源的收集和保护具有重大的历史和现实意义。 杉木王因年龄长、树冠大、树干高、易受到风折、雪压、雷击以及病虫害等影响，福建省现存的杉木王数量较少，均属于国家古树保护范围。因此，很有必要采用在种质资源原地保存区进行原地保存，通过扦插、组培等方式异地扩繁杉木王种质，建立杉木王种质资源基因库等方法 ，对福建杉木王种质资源进行保护和利用^[20]。 同时，积极开展杉木王资源的遗传育种研究，对部分优良资源进行栽培化、品种化试验，加强对杉木王珍贵遗传资源的开发利用。