植物作为自然界一大天然宝库,很多萜烯类、氨基酸和多糖等^[1]都可以由植物产生,而这些化学物质中的很大一部分都具有杀虫或抗菌的活性,这些化学物质就是植物提取物。木腐菌容易感染伐倒木的边材,而人们很早就知道耐腐树种的心材其耐腐能力很好^[2]。近年来,人们对植物活性物质的开发和利用渐渐加强^[3]。人类将天然的提取物运用在木材保存方面的历史由来已久,如用涂刷过桐油的木材建造房屋,其防腐效果很好。树木中含有酚类、单宁等多种抑菌成分^{[4, 5]},如将其提取出来并合理利用,必将在木材防腐方面取得突破,并取得效益。

杉木[Cunninghamia lanceolata(Lamb.)Hook.]是裸子植物,杉科(Taxodiaceae),杉木属(Cunninghamia R. Br),为常绿乔木,主要分布在中国秦岭、大别山以南各省。杉木是中国南方最重要的优良、速生用材树种^[6],其生长速度快、材质轻软、纹理通直、结构均匀、耐腐性强^[7]。目前柏木脑等抑菌物质被认为可能是使杉木具有较强耐腐性的原因,而对其它组分的抑菌性能,以及不同极性大小的溶剂杉木提取物的抑菌测定,相关报道研究较少^[8]。文中就杉木提取物对木材腐朽菌的毒力进行测定,以便探索杉木心材提取物的抑菌防腐能力,并从杉木中提取有效成分用作木材防腐的可行性研究。

[Coriolus versicolor (L. ex Fr.) Quél.],由中国林业微生物菌种保藏管理中心供应;密粘褶菌即褐腐菌[Gloeophyllum trabeum (Pers. ex Fr.) Murr.],由福建农林大学生命科学学院供应。

杉木心材碎料和锯屑取自福建省邵武市,风干并用粉碎机粉碎后过筛,目数为40-60目,将得到的杉木心材粉置于冷冻室中密封保存待用。

蒸馏水自制;甲醇、三氯甲烷、丙酮、石油醚、乙酸乙酯均为分析纯,由天津市富宇精细化工有限公司生产;马铃薯、琼脂以及麦芽糖等,购买于市场。

称取200 g去皮土豆,15 g琼脂,20 g麦芽糖,量取1 000 mL的蒸馏水,将以上材料加热溶解混合并过滤,然后稀释定容到1 000 mL,平均装到6个150 mL的锥形瓶中,随后高压灭菌(30 min,121 ℃)。

提取方法为热回流提取,分别将100 g的 40-60目杉木心材装进圆底烧瓶,用6种化学溶剂(甲醇、乙酸乙酯、丙酮、三氯甲烷、石油醚、蒸馏水)进行提取。提取过程分2次,第1次按料液比1∶7 (g·mL^-1)提取5 h并过滤,第2次按料液比1∶5 (g·mL^-1)提取3 h并过滤,共提取8 h,之后将2次的滤液进行混合,并用旋转蒸发仪进行减压蒸发,得到膏状物。随后,将膏状物质装好并用相应溶剂配好浓度,放入4 ℃冰箱中待用。

采用生长速率法^[9]测定6种化学溶剂的杉木心材提取物对白腐菌及褐腐菌生长的抑制率。先将2种木材腐朽菌接在马铃薯葡萄糖琼脂培养基[potato dextrose agar(medium)],即PDA培养基平板上分别进行培养,时间为7 d左右,将灭菌后的培养基加热熔化,冷却到50 ℃左右,用移液枪分别量取供试样品到灭菌的盛有一定量培养基的培养皿中并摇匀,抑制褐腐菌的5种溶剂含药培养基浓度见表1,抑制白腐菌的5种溶剂含药培养基的浓度见表2,同时设置空白对照组。然后在超净工作台上进行接菌操作,沿着菌落的外围,用打孔器制取菌丝块,直径为7.0 mm,试验中要控制条件为无菌,用接种环移到上述6个培养皿的中央(每种溶剂含药培养基都设置5个浓度梯度,再加上空白对照的培养皿,则每种溶剂含药培养基都要用到6个培养皿。此外,为避免化学溶剂对2种真菌的抑制作用,设置1组 6 个空白对照,分别将1 mL 的6种试剂加入到相对应的对照组培养皿中。在试验过程中发现微量的甲醇溶剂都会对2种木材腐朽菌产生较强的抑制作用,而其他5种溶剂对木材腐朽菌的抑制作用不明显,所以在移入菌丝块之前要让含药培养基中的甲醇溶剂挥发。),试验重复3次,随后在28 ℃的恒温恒湿培养箱中培养。当对照组的菌丝约长到培养皿直径的2/3时,就可以对菌落的生长直径进行测量,方法为"十字交叉法",并计算出平均值,抑菌率计算如下

半最大效应浓度(concentration for 50% of maximal effect,EC₅₀),即毒力的EC₅₀值,指的是在一定时间内,一半的试验物出现某种伤害的毒物浓度,在文中指的是抑制50%菌体的生长所对应的药剂的浓度,此值越小,则抑菌效果越好。毒力EC₅₀值的计算方法:由抑菌率与几率值的换算关系,得到每个抑菌率所对应的几率值,用x表示试验浓度的对数值,Y表示抑制率对应的几率值(从"几率值表"中查对得到),即以几率值为纵坐标,浓度对数为横坐标作图。用各化学溶剂提取物的各个浓度的对数值(x)减掉几率值(Y),即得到毒力回归方程:Y=a+bx,最后算出毒力EC₅₀^[10]

由表3可知,除蒸馏水外,其他溶剂中,提取物的得率与溶剂极性为正相关,即甲醇>丙酮>乙酸乙酯>三氯甲烷,石油醚为非极性溶剂,其提取物得率最低。

从图1可看出,5种溶剂提取物的抑制作用随着浓度的升高而增大,与浓度呈正相关,这是因为随着浓度的升高,含药培养基里抑菌活性成分的浓度也相应增大。在浓度为1.000 0 g·L^-1时,丙酮、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇提取物对采绒革盖菌的抑菌率分别为:64.24％>55.78%>52.26％>50.76%。其中,杉木心材丙酮提取物对采绒革盖菌的抑制率在65%左右,在同剂量下,明显高于其他几种的抑制率。

	图1 杉木心材不同溶剂提取物对采绒革盖菌的抑制活性 Figure.1 Antifungal activity of different solvent extracts against Coriolus versicolor
图选项

从图2可知,除蒸馏水外,杉木心材5种溶剂提取物,都对密粘褶菌的生长具有抑制作用。甲醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿提取物在浓度为0.500 0 g·L^-1时对褐腐菌的抑菌率分别为:52.19％、47.27％、45.80%、43.53％,甲醇提取物的抑制率最高。从整体趋势来看,除蒸馏水外,其他5种溶剂提取物的抑菌效果随浓度的增加而提高。

	图2 杉木心材不同溶剂提取物对密粘褶菌的抑制活性 Figure.2 Antifungal activity of different solvent extracts against G. trabeum
图选项

由表4可见,除了蒸馏水外,杉木心材5种提取物的浓度与抑菌效果呈正相关,毒力回归方程的相关系数R²均大于0.900 0,说明当浓度升高时,提取物对白腐菌的抑制效果随之加强。杉木心材5种溶剂提取物对白腐菌的EC₅₀值为0.633-11.677 g·L^-1。根据EC₅₀值,杉木心材5种溶剂提取物对采绒革盖菌的抑制强弱顺序为:丙酮提取物>甲醇提取物>乙酸乙酯提取物>三氯甲烷提取物>石油醚提取物。在木材防腐应用方面,针对采绒革盖菌的EC₅₀值,杉木心材提取最适化学试剂为丙酮。但与传统的氨溶铜季铵盐或碱性铜季铵盐(ammoniacal copper quaternary,ACQ)木材防腐剂,即ACQ木材防腐剂相比,丙酮提取物的EC₅₀值比ACQ大很多^[11]。

由表5可以看出,除蒸馏水外,杉木心材5种溶剂的毒力回归方程的相关系数R²都大于0.900 0,抑菌效果与浓度呈正相关。5种提取物对密粘褶菌的EC₅₀值为0.355-20.289 g·L^-1。根据EC₅₀值,针对褐腐菌,杉木心材5种有机溶剂提取物的抑制强弱顺序为:甲醇提取物>丙酮提取物>乙酸乙酯提取物>三氯甲烷提取物>石油醚提取物。根据密粘褶菌的毒力测定效果,得知最适溶剂为甲醇,但其抑菌能力相比ACQ相对较弱^[11]。

从总体来看,除了蒸馏水外,杉木心材5种溶剂提取物对采绒革盖菌的EC₅₀值为0.633-11.677 g·L^-1,且抑制效果与浓度呈正相关。其中,杉木丙酮提取物的EC₅₀值最低,为0.633 g·L^-1。根据EC₅₀值,其抑制强弱顺序为:丙酮提取物>甲醇提取物>乙酸乙酯提取物>三氯甲烷提取物>石油醚提取物。所以,在耐采绒革盖菌方面,丙酮是最好的杉木心材提取溶剂。

对于密粘褶菌,除了蒸馏水外,杉木心材5种溶剂提取物均表现出不同程度的抑制作用,并且抑制效果与浓度呈正相关。5种提取物对密粘褶菌的EC₅₀值为0.355-20.289 g·L^-1,其中杉木甲醇提取物的EC₅₀值最低,为0.355 g·L^-1。其抑制强弱顺序为:甲醇提取物>丙酮提取物>乙酸乙酯提取物>三氯甲烷提取物>石油醚提取物,所以甲醇提取物对密粘褶菌的抑制作用最强。研究结果探明了杉木心材提取物对密粘褶菌和采绒革盖菌的抑菌活性,并为杉木在生产加工过程中产生的剩余物的合理利用提供了科学依据,对于开发研究天然防腐剂也有重要意义。