龙眼(Dimocarpus longan Lour.)成熟期多为8-9月高温季节,采后生理代谢旺盛,鲜果易变色、变质,在28 ℃室温下1周左右全部变质腐烂^[1]。因病原菌的侵染导致采后龙眼的腐烂损失高达50%^[2],其中,真菌病害是影响龙眼果实货架期的主要因素^{[3, 4, 5]}。

相关研究表明,丁香等植物提取物对微生物的生长有一定的抑制作用^{[6, 7, 8, 9, 10, 11]},在对多种植物提取物抑菌活性初筛的基础上,选择丁香(Syzygium aromaticum L.)、甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch)、花椒(Zanthoxylum bungeanum Maxim)、高良姜(Alpinia officinarum Hance)4种安全无毒的药食两用植物,通过比较这几种植物提取物对龙眼果实低温贮藏主要致腐病菌的抑制效果,为将其开发为安全无毒植物源抑菌剂奠定基础。

以福建省莆田市主栽的名优品种乌龙岭(Dimocarpus longan Lour. ' Wulonglin’),松风本(Dimocarpus longan Lour. 'Songfengben’)的果实为供试材料。该材料采自莆田市华亭果场,选择无病虫、无损伤的健康果实进行分离主要致腐真菌试验;以PDA为真菌固体培养基,以PD为真菌液体培养基;以丁香、甘草、花椒和高良姜4种常见药食两用植物为体外抑菌试验材料,4种植物均购自紫金药店,其拉丁文学名和供试部位详见表1。

取新鲜未经保鲜处理的龙眼进行消毒,用体积分数为75%的乙醇溶液浸没30 s,再[CM(16*2]用质量分数1 %的次氯酸钠溶液浸没20 min,然后用无菌水清洗3遍,置于灭菌的广口瓶中,低温(4 ℃)下贮藏30 d^[12]。取有腐烂迹象龙眼在无菌环境下用已消毒的镊子轻轻剥开龙眼蒂部果皮,取与果皮接触部位果肉接种于PDA培养基,置于25 ℃的恒温培养箱中培养48 h以上。根据菌落形态初步分类,将分离频率较高的菌落进行纯化培养,根据菌落形态、分生孢子座及孢子的形态,结合相关资料进行菌的初步鉴定,然后将该菌用点刺法^[12]复染健康无病斑的龙眼叶及果实,以无菌水点刺为空白对照进一步验证鉴定结果。

将洗净晾干的供试中草药样品粉碎,过40目筛,取粉碎样品20 g,加入200 mL体积分数为75%的乙醇,静置浸泡12 h;再于78 ℃的水浴中浸泡4 h,然后经8层经消毒的纱布过滤,取滤液^[6],得到体积质量为100 mg·mL^-1的提取液,将该提取液置于4 ℃ 冰箱保存。

将上述丁香、花椒、甘草、高良姜提取液制成15种药液(表2)备用。将致腐真菌接种于PDA斜面,25 ℃下培养15 d左右可见黑色分生孢子,用无菌水洗下孢子,将孢子稀释成在10×10倍显微镜视野下观察到10个分生孢子的悬浮液,每个PDA平板上均匀涂布200 uL孢子悬浮液,再均匀放上牛津杯,中间是75%乙醇溶液作为对照,周围是待检测药液,依次编号为0-15。置于25 ℃恒温箱内培养72 h,测量抑菌圈的直径,纵横各1次,取平均值。重复3次。

各组均以10 g丁香粉末加入100 mL乙醇于恒温振荡器提取,转速均为150 r·min^-1,以乙醇浓度、提取温度及提取时间3个因素进行正交设计:乙醇浓度设置3个水平即50%、75%、95%;提取温度设置30 ℃(室温)与60 ℃两个水平;提取时间设置4个水平即15、24、48、72 h。提取完成后,用8层纱布过滤,将滤液(体积质量为100 mg·mL^-1)置于4 ℃冰箱。抑菌检测方法1.2.3。

挑取拟茎点霉至PD培养液中混匀备用。将体积质量为100 mg·mL^-1的丁香提取液用PD培养液逐级稀释,使1-7号试管中均有1 mL的孢子悬液和丁香体积质量分别为50.00、25.00、12.50、6.25、3.13、1.56、0.78 mg·mL^-1的含药培养液,并以不加孢子悬液及不含药培养液为对照,置于25 ℃的恒温培养箱中72 h。重复3次。观察有无菌落生长,无菌生长的药液中浓度最低的即为丁香提取液的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)。从不能明显看到有菌落存在的试管各取200 uL分别涂布平板,置于25 ℃的恒温培养箱中72 h,观察有无菌落生长,无菌落生长的药液浓度最低的一组即为最小杀菌浓度(minimal bactericidal concentration,MBC)。

从低温贮藏的腐败龙眼果实中得到5种菌落,按分离频率从大到小的顺序编号1-5,如图1所示:1号菌落稍厚并且气生菌丝白色絮状具轮纹,菌落背面呈浅褐色;2号菌落中间部位呈浅绿色,周边为白色边缘,较为稀薄,颜色较亮,菌落背面呈棕色;3号菌落为棉絮状,粉色,中间部位相对周边较为突出,菌落背面为暗黄色,可看到中央有深色的斑点;4号菌落为深绿色,色泽较暗,菌落稀薄,菌落背面呈深绿色,周边为暗黄色;5号菌落为浅绿色,但颜色较2号颜色更淡,周边亦有白色边缘,与2号菌相比白色边缘比较宽,菌落背面中间为深黄色,边缘颜色较浅。

其中1号菌分离频率较高,达60%以上,将1号菌继续在25 ℃培养,15 d后菌落由白色变为黑色(图2)。而保藏在4 ℃的5种分离菌,15 d后唯有1号菌可看到菌落更加密集并有明显的颜色改变(图2),而其他4种菌形态及颜色与图1相同,说明1号菌在低温(4 ℃)条件下继续生长但相对于25 ℃下生长速度较为缓慢(图2)。在显微镜(10×100)下,可观察到1号菌的分生孢子器呈黑色,有单腔也有双腔;孢子丝状,一端弯曲,无色,单个,上述性状与龙眼拟茎点霉(Phomopsis longanae Chi)的性状描述一致^{[12, 13, 14, 15, 16, 17, 18]},初步判断1号菌为龙眼拟茎点霉。在该菌的复染试验中,果实接种3 d后初期感病部位呈水渍并伴随白色菌丝长出,而后长出黑色分生孢子器,导致果粒腐烂,而无菌水点刺对照组7 d内有个别果实感病现象而且感病症状不一。接种叶片3 d后,病斑褐色,然后呈"V"字型向下延伸,后期在病部上长出小黑点,对照组在7 d内无发病现象。1号菌的果实及叶复染感病症状与龙眼拟茎点霉自然发病一致^{[16, 17, 18]},进一步验证了1号菌为龙眼拟茎点霉。

	图1 5种龙眼致腐病菌菌落正面与背面形态 Figure.1 Front and back of the colony of 5 species of longan pathogen 注:正面Front,背面Back。
图选项

	图2 1号菌在不同温度15 d后的菌落正面与背面形态 Figure.2 Front and back of the colony of pathogen No.1 at different temperature for 15 days 注:正面Front,背面Back。
图选项

试验组在25 ℃恒温培养箱中培养5 d,分别表现出不同程度的抑菌作用,1号丁香提取液在抑菌试验中形成的抑菌圈直径最大,为25.83 mm,含有丁香的组合都有不同程度的抑菌作用,与对照组之间达到极显著差异(P＜0.01)(表3),而其他提取液单独存在时则抑菌效果甚微,如2、3、4、8、9、10、14号组及对照组75%乙醇均未形成抑菌圈,由此可见,丁香在抑菌中起决定作用。综上,丁香提取液对龙眼拟茎点霉具有较佳的抑制作用。

不同条件提取的丁香提取物对龙眼拟茎点霉的抑菌活性不同(表4)。15-72 h内,随提取时间的延长,各组丁香提取物抑菌圈直径均有所增大,提取72与48 h在抑菌效果上并没有很大的差别;以75%乙醇作为提取溶剂时抑菌圈直径最大,为35.10 mm;提取温度以室温效果较好。综上,丁香提取液的较佳提取条件为室温下用75%乙醇提取48 h。

1-7号管培养72 h,与其对应的空白对照组对比,在1-4号管内未明显看到有菌生长,在5-7号管内均看到不同程度的菌落生长。将1-4号管内带药的菌培养液接种于PDA平板,25 ℃恒温培养箱中放置72 h,除4号外,在1-3号管内均未观察到有菌生长(图3)。因此,可以证明4号管的丁香提取液的浓度(6.25 mg·mL^-1)仅抑制龙眼拟茎点霉的生长速度,并未杀死。而浓度更高的3号管(12.50 mg·mL^-1)、2号管(25 mg·mL^-1)、1号管(50 mg·mL^-1)则将菌杀死,所以,丁香提取液的最小抑菌浓度为6.25 mg·mL^-1,最小杀菌浓度为12.50 mg·mL^-1。

	图3 1-4号管含药平板培养结果及空白对照 Figure.3 Culture results on the extracts-containing plates for tubes 1 to 4 and the control blank plate
图选项

目前,低温贮藏是龙眼保鲜相对绿色的贮藏方式,而在低温贮藏条件下,拟茎点霉的分离频率较高,这与前人研究结果一致^[12],而且发现拟茎点霉在4 ℃下还能继续明显生长,推测该菌是导致龙眼低温贮藏条件下腐烂的主要致病菌。龙眼拟茎点霉在龙眼产地普遍发生,可为害龙眼叶片造成叶枯病^[16],病叶上的龙眼拟茎点霉是采后龙眼果实贮藏期真菌性病害的主要初侵染来源^{[17, 18]},对该菌的控制研究具有较大的经济价值。

植物源杀菌剂如丁香等,由于本身就是可食用的香料,因其低毒、无残留的特性,且抑菌乃至杀菌效果显著而备受关注,丁香的乙醇提取液中主要成分为丁香酚,对多种细菌、真菌的生长具有抑制甚至致死作用^{[6, 7, 8, 9, 10, 11]},丁香提取液的体积质量为12.50 mg·mL^-1就可杀死拟茎点霉,不仅不会影响龙眼的口感,还可以在一定程度上给龙眼增香,有望将其开发为绿色的龙眼树木杀菌剂及龙眼果实保鲜剂。

本实验仅探讨了丁香提取液对拟茎点霉的离体抑菌及杀菌浓度,若用于龙眼树木杀菌及龙眼果实保鲜,则应提高丁香提取液的使用浓度,如何做到合理有效的应用尚需进一步的研究。