桉树(Eucalyptus spp.)是中国南方主要造林树种,桉树焦枯病则是桉树种植区常见的病害,其由丽赤壳属(Calonectria)真菌引起^{[1, 2]},主要危害桉树的叶片,严重影响桉树的生产量。目前对桉树焦枯病的防治研究主要集中在化学杀菌剂防治^[3]。植物中含有大量的天然活性物质,在进化过程中,其体内逐渐形成保护自身免受侵害的化学物质,目前已知植物能够产生40多万种次生代谢物,其中大多数代谢物质都有抑制致病菌落生长及杀死害虫的作用^{[4, 5, 6]}。此外,使用植物源农药不仅能提高植物的免疫能力,还能刺激植物的生长,对防治病害和增产都有效果,是一种环境友好型的天然杀菌剂^{[7, 8]}。

桉树焦枯病菌(Calonectria spp.)中类柯氏丽赤壳(C. pseudocolhounii)和瑞丽赤壳(C. pseudoreteaudii)是引起福建省桉树焦枯病的主要病原^{[9, 10]},由于福建桉树速生丰产林的大面积种植,桉树焦枯病的发生面积逐年增加,甚至暴发成灾。因此,本课题组分别以纯水和无水乙醇对11种木本植物进行成分粗提取,采用生长速率法研究其对2种桉树焦枯病病菌(类柯氏丽赤壳、瑞丽赤壳)的生物抑菌活性,筛选具有抑制桉树焦枯病菌作用的植物粗提物,为植物性杀菌剂和新型植物源农药的开发提供理论基础。

所有供试植物样品均采自福建农林大学校内,分别是广玉兰(Magnolia grandiflora L.)、银杏(Ginkgo biloba L.)、八月桂(Osmanthus fragrans 'Tbubergii’)、樟树[Cinnamomum camphora (L.) Presl]、红花檵木(Loropetalum chinense Olive var. rubrum Yieh)、青丝黄竹[Bambusa eutuldoides McClurevar. viridi-vittata (W. T. Lin) Chia]、白兰(Michelia alba DC.)、台湾相思(Acacia confusa Merr.)、杨梅[Myrica rubra (Lour.) Sieb. et Zucc.]、柠檬桉(Eucalyptus citriodora Hook. f.)、羊蹄甲(Bauhinia purpurea L.),提取部位均为叶片。

2种桉树焦枯病菌(类柯氏丽赤壳、瑞丽赤壳)由福建农林大学森林保护研究所提供。

将采集的植物样品洗净,置于通风处自然阴干,将阴干后的植物叶片放入50 ℃的恒温鼓风干燥箱中烘干至恒重,然后用小型的粉碎机粉碎,过40目筛,获得植物粉末。将过筛后的植物粉末用自封袋装好,于4 ℃冰箱内保存。分别称取粉碎好的11种植物样品粉末各30 g放入500 mL锥形瓶中,分别加纯水或无水乙醇试剂240 mL,在室温下浸提48 h,且每隔12 h振荡1次。对植物浸提液进行真空抽滤,重复2次。将2次抽滤所得滤液合并,放入500 mL的旋转蒸发瓶中,用旋转蒸发仪在50 ℃的水浴中旋转减压浓缩,当溶液浓缩至原体积的1/10时,将浓缩的溶液全部移到250 mL的锥形瓶中,自然风干至膏状,称重,计算各植物粗提物的提取率,而后将锥形瓶密封,放置于4 ℃冰箱中储存备用。

将9 mL的麦芽浸膏培养基(malt extract agar,MEA)熔化并冷却到50 ℃左右,于无菌工作台中加入1 mL供试粗提物,振荡并摇匀后倒入培养皿中,制成抑菌培养基,试验分别设添加无菌水对照组和无水乙醇对照组。无菌水对照组为1 mL的无菌水和9 mL的MEA。无水乙醇对照组为1 mL无水乙醇和9 mL的MEA。每组设3次重复。用直径为6 mm的打孔器打取刚培养好的供试菌菌饼,菌丝朝下放于抑菌培养基中央,在25 ℃条件下培养,定期观察并在7 d后用十字交叉法测定菌饼的直径,用多次测量的平均值表示菌落直径的大小。

纯水和无水乙醇对供试的11种木本植物粗提物的提取率存在显著差异,且同种浸提剂对不同植物粗提物的提取率也存在显著差异。浸提剂对木本植物粗提物提取率的影响如图1所示。从图1可以看出,除了柠檬桉,纯水对供试植物粗提物的提取率均高于无水乙醇。柠檬桉、樟树、杨梅、银杏、红花檵木和白兰粗提物的提取率均高于20%。青丝黄竹粗提物的提取率最低。

各植物的水粗提物对2种桉树焦枯病菌的抑制效果如图2所示。从图2中可以看出,总体上11种植物水粗提物对瑞丽赤壳菌落生长的抑制效果好于类柯氏丽赤壳。其中银杏、红花檵木和八月桂粗提物对瑞丽赤壳的抑制效果最好,抑制率分别为100%、94.28%和85.24%。而柠檬桉的水粗提物对瑞丽赤壳的生长无抑制作用。对类柯氏丽赤壳的活性筛选结果表明,八月桂水粗提物具有一定的抑制效果,抑制率为40.04%。樟树、台湾相思、青丝黄竹、广玉兰、杨梅、红花檵木和白兰的水粗提物对类柯氏丽赤壳的生长则有一定的促进作用。

	图1 11种植物在不同溶剂处理下粗提物的提取率 Figure.1 Extraction rates of 11 plants soaked with distilled water and absolute ethyl alcohol
图选项

	图2 11种植物水粗提物对2种桉树焦枯病菌的抑制率 Figure.2 Inhibitory rates of 11 plant extracts soaked with distilled water on Calonectria spp.
图选项

各植物的无水乙醇粗提物对2种桉树焦枯病菌的抑制效果如图3所示。从图3中可以看出,11种植物粗提物中,5种植物的粗提物对类柯氏丽赤壳的生长存在抑制作用,8种植物粗提物对瑞丽赤壳的生长存在抑制作用。其中广玉兰无水乙醇提取物对2种桉树焦枯病菌的抑制效果最好,抑制率分别为73.36%和57.50%。其次是柠檬桉无水乙醇粗提物,抑制率均大于40%。白兰无水乙醇粗提物对2种桉树焦枯病菌也具有一定抑制作用。台湾相思、八月桂和羊蹄甲对2种桉树焦枯病菌的生长则是促进作用。

运用Excel软件拟合方程,获得广玉兰无水乙醇粗提物对类柯氏丽赤壳的毒力方程为Y=81.55X-12.57,R²=0.97。由毒力回归方程可知,当广玉兰无水乙醇粗提物浓度为0.77 g·mL^-1时,抑制率为50%;当广玉兰无水乙醇粗提物浓度超过1.26 g·mL^-1时,抑制率达到90%以上。

	图3 11种植物无水乙醇提取物对2种桉树焦枯病菌的抑制率 Figure.3 Inhibitory rates of 11 plant extracts soaked with absolute ethyl alcohol on Calonectria spp.
图选项

银杏水粗提物对瑞丽赤壳的毒力回归方程为Y=85.929 0X+9.013 8,R²=0.96。当银杏水粗提物浓度为0.48 g·mL^-1,抑制率达到50%时;当银杏水粗提物浓度超过0.94 g·mL^-1时,抑制率达90%以上。

目前桉树焦枯病的防治方法多采用化学防治、改善营林措施、抗病品种选育等^{[11, 12]}。唐芬等^[13]利用不同浓度的水杨酸喷施桉树叶片来提高桉树抗焦枯病菌的作用效果,结果显示适宜浓度的水杨酸能够显著提高桉树对焦枯病菌的抗性。朱建华等^[3]分别采用化学农药结合营林措施技术对桉树焦枯病进行防治,结果认为达科宁的化学防治效果最佳,而施肥处理也能够明显提高桉树对焦枯病害的防御能力,两者相互结合对焦枯病侵害严重的桉树具有较好的缓解作用。然而,化学农药成分单一,若长期大量使用,不仅造成残留严重,还将导致病原菌的耐药性不断增强,以致需要不断开发毒性更强的新型化学农药,导致恶性循环。此外,桉树不仅是造纸和纤维制品的重要原材料,还是良好的蜜源植物,可用于酿酒和入药,因而桉树农残量还直接影响食用安全^[14]。因此,避免高毒农药的大量使用,寻找环境友好、有害生物很难产生抗药性的植物源农药将是一个必然的发展趋势^[15],研究利用植物天然产物的抑菌活性对桉树的病害进行防治,对于减少化学农药在桉树病害防治中的使用具有重要的意义。

广玉兰、银杏、白兰等木本植物是中国南方的常见树种,叶片资源丰富,是提取植物天然化学产物的实用原料。本课题组分别利用无水乙醇和水溶剂对广玉兰、银杏、八月桂等11种木本植物叶片进行提取,在11种供试木本植物粗提物中,广玉兰无水乙醇粗提物对类柯氏丽赤壳菌丝生长的抑制作用最好。这可能与广玉兰的叶子中含有丰富的挥发油、黄酮类、木兰花碱、酚类和倍半萜内酯等多种化学成分有关^{[16, 17, 18]}。这些物质对真菌和细菌均有一定的抑制作用。AHMED et al^[19]也发现广玉兰的浸提物对交链格孢菌(Alternaria alternata)、禾长蠕孢属(Helminthosporium spp.)、黑孢菌(Nigrospora spp.)、立枯丝核菌(Rhizocotonia solani)等多种植物病原真菌具有良好的抑菌活性。对广玉兰无水乙醇粗提物的毒力回归方程分析结果发现,当其浓度为0.77 g·mL^-1时,其对病菌的生长抑制率为50%,当其浓度大于1.26 g·mL^-1时,抑菌率可达90%以上。研究结果显示,1 g·mL^-1的广玉兰无水乙醇粗提物对类柯氏丽赤壳菌丝抑制率大于70%,表明广玉兰可作为抑制桉树焦枯病菌类柯氏丽赤壳植物源农药的主要原材料。

对瑞丽赤壳而言,1 g·mL^-1的银杏水粗提物能够完全抑制其生长,效果十分显著,其毒力方程为Y=85.929 0X+9.013 8。这可能与银杏叶粗提物中含有多种活性成分如银杏酸、银杏黄酮、银杏内酯等有关,这些物质对细菌和真菌均有抑制作用^{[20, 21, 22, 23]}。由此可见,从植物组织中提取的天然化合物具有良好的抑菌效果,且由于这些提取物中含有不同的化学成分,抑制效果更强,不利于病原菌抗性的形成,可作为开发病菌绿色生态防治技术的有效保障。

本试验选用11种木本植物对2种桉树焦枯病菌的抑菌活性进行初步筛选,研究结果为利用植物源农药防治桉树焦枯病提供了一定的理论基础,具有一定的实践意义。但供试植物对桉树焦枯病菌主要的抑菌活性物质及其结构、抑菌机理,以及这些植物提取物对其他桉树焦枯病病原菌的抑制作用还有待进一步深入研究。