桉树枝瘿姬小蜂(Leptocybe invasa Fisher et La Salle)是全国林业危险性有害生物^{[1, 2]}。目前对该虫的防控措施主要是采取化学药剂防治^{[3, 4]},但实践中该虫化学药剂防治效果不佳,且大量使用化学药剂将带来一系列生态环境问题,因此,亟需寻找一种更有效、更安全的防治措施。茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)是一种诱导植物防御反应的重要的信号物质^[5]。许多研究表明,MeJA可诱导植物产生化学防御反应,显著提高相关防御酶的活性,增强植物的抗虫性,从而影响植食性昆虫行为、生长发育和繁殖力^{[5, 6, 7]}。MeJA诱导植物抗虫性是近年来植物抗性研究的热点之一,相关研究涉及多种植物^{[6, 7, 8, 9]},而有关外源MeJA诱导巨桉(Eucalyptus grandis Hill ex Maiden)幼苗抗桉树枝瘿姬小蜂及相关防御酶活性变化的研究较少。本课题组测定了喷施外源MeJA处理后,巨桉幼苗相关防御酶活性的变化,以及对桉树枝瘿姬小蜂繁殖力、种群动态和防治效果的影响,可为揭示MeJA诱导桉树植株的抗虫机制提供理论依据。

供试苗木:来源于福建农林大学苗圃培育的巨桉组培苗,苗龄6个月,苗高40 cm左右。

供试虫源:在桉树枝瘿姬小蜂成虫羽化期,采集受害苗木上的虫瘿放入人工气候箱内培养,温度35 ℃,相对湿度80%,光周期18 h光照∶6 h黑暗,并用集虫管收集羽化的雌蜂供试。

供试药液:供试MeJA制剂为美国Sigma-Aldrich公司产品,纯度≥95%,以少量的乙醇溶解,再用蒸馏水配制成0.05、0.10、0.50和1.00 mmol·L^-1四种浓度的溶液,备用。

将4种不同浓度的MeJA溶液用喷雾器均匀地喷洒在供试苗木上,使全株湿润,然后迅速将供试苗木放置于养虫笼内,并用塑料薄膜密封处理24、48、72、120和148 h。以无菌蒸馏水喷施苗木作为对照。

按24、48、72、120和148 h处理时间节点从苗木的东、西、南、北4个方向各剪取10片嫩叶(包括叶柄),装入保鲜袋内,带回室内冷冻保存(-80 ℃)。每个处理设3次重复,每重复3株苗木。测定样品中苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonialyase,PAL)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化物酶(peroxidase,POD)和多酚氧化酶(polyphemol oxidase,PPO)4种防御酶活性^{[10, 11]},以及胰蛋白酶抑制剂(trypsin inhibitors,TI)和胰凝乳蛋白酶抑制剂(chymotrypsin inhibitors,CI)2种植物蛋白酶抑制剂活性^{[12, 13]}。每份样品重复测定3次。

处理148 h后,从东、西、南、北4个方向各选取供试苗木枝条3条,共12条,套上尼龙网袋,分别接入当天采集的雌蜂20只。接虫处理后10 d,每枝随机选择5片叶子观察,统计叶柄和叶脉上雌蜂产卵刻痕数量。接虫后2-3个月,剪取苗木枝条上新长成的虫瘿30个,以每个虫瘿上圆形的羽化孔作为出蜂数量,并按不同处理分别置于养虫盒内,放入人工气候箱,温度30 ℃,相对湿度80%,光周期18 h光照∶6 h黑暗内收集成蜂。每天定时收集统计由虫瘿中羽化出孔的成虫数量和雌性比,并收集100只雌蜂放入冰箱速冻10 min(-20 ℃)。用电子天平(精度0.1 mg)称量,计算雌蜂体重。从中随机取30只雌蜂,放入质量分数为0.9％的NaCl无菌水溶液内,在体视镜下解剖,观察并记录每只雌蜂的怀卵量。在室温下(24-28 ℃),观察记录雌蜂的存活时间。

统计以处理植株为食的子代桉树枝瘿姬小蜂繁殖力情况,计算种群趋势指数^[14]和防治效果。

利用Microsoft Excel 2007和DPS V7.05软件对试验数据进行统计分析,采用Duncan's新复极差法对处理间的差异显著性进行检测。

从图1(a)可知,经不同浓度MeJA处理后,巨桉叶内PAL活性均发生明显变化,其活性极显著高于对照(P < 0.01)。除0.05 mmol·L^-1MeJA处理叶片PAL活性变化不大外,0.10和0.50 mmol·L^-1处理PAL活性逐步上升,1.00 mmol·L^-1处理PAL活性呈先下降,后上升趋势。其中,以0.50 mmol·L^-1MeJA处理后的PAL活性变化最大,并在第120 h PAL活性达最高值(37.46 U·g^-1),比对照增加了82.68%。对照叶片中PAL活性时序变化不大,总体保持平稳。

	图1 不同浓度MeJA处理对巨桉叶片PAL、SOD活性的影响 Figure 1 Effects of MeJA on the PAL,SOD activities of E. grandis leaves
图选项

从图1(b)可知,经不同浓度MeJA处理后,桉叶内SOD活性均发生极显著变化(P < 0.01)。叶片中SOD活性呈现出先下降,后上升,再下降的波动趋势,其中以0.50 mmol·L^-1MeJA处理的SOD活性值显著高于其它浓度处理,并在第72 h SOD活性最高,为46.27 U·g^-1,比对照增加90.33%。对照叶片中SOD活性时序变化不大,总体保持平稳。

从图2(a)可知,经不同浓度MeJA处理后,桉叶内POD活性均发生明显变化(P < 0.05)。叶片中POD活性呈现出先上升,后下降,再上升,再下降的波动趋势,其中以1.00 mmol·L^-1MeJA处理的POD活性值显著高于其它处理,并在第120 h后POD活性最高,为3 777.49 U·g^-1,比对照增加151.79%;0.05和0.10 mmol·L^-1MeJA处理后桉叶内POD活性,与对照叶片相比变化不明显,在第72 h略低于对照。

	图2 不同浓度MeJA处理对巨桉叶片POD、PPO活性的影响 Figure 2 Effects of MeJA on the POD,PPO activities of E. grandis leaves
图选项

从图2(b)可知,经不同浓度MeJA处理后,桉叶内PPO活性均发生明显变化(P < 0.05)。除0.50 mmol·L^-1MeJA处理桉树叶片PPO活性呈先下降,后上升趋势外,其余处理均呈现出先上升,后下降的趋势,其中1.00 mmol·L^-1MeJA处理的PPO活性在前72 h明显高于其它处理,第48 h达到峰值125.21 U·g^-1,比对照增加73.02%,但第120 h后略低于0.50 mmol·L^-1处理的PPO活性。对照叶片中PPO活性呈上升趋势,但变化幅度不大。

从图3(a)可知,经不同浓度MeJA处理后,桉叶内TI活性均发生极显著变化(P < 0.01)。桉叶中TI活性值均显著高于对照,TI活性呈现先上升,逐渐下降,72 h后缓慢上升的趋势,且MeJA浓度越高,TI活性值增幅就越大,其中以1.00 mmol·L^-1MeJA处理的TI活性值在第48 h时达到峰值38.12 U·g^-1,比对照叶片增加143.98%。

	图3 不同浓度MeJA处理对巨桉叶片TI,CI活性的影响 Figure 3 Effects of MeJA on the TI,CI activities of E. grandis leaves
图选项

从图3(b)可知,经不同浓度MeJA处理后,桉叶内CI活性均发生了不同程度的变化(P < 0.05)。叶片中CI活性呈现出逐渐下降的趋势,其中1.00 mmol·L^-1MeJA处理的CI活性值与其它处理相比都较高,并在第24 h时CI活性值达高峰值25.35 U·g^-1,与对照相比增加107.96%。对照叶片中CI活性随时间变化呈先下降,后上升,再下降的趋势,但总体保持平稳。

经MeJA处理后,在供试苗木上接入桉树枝瘿姬小蜂雌蜂,经1个世代(2-3个月),观察桉树枝瘿姬小蜂子代生长发育和繁殖力指标,计算种群趋势指数,结果见表1。结果表明:不同处理后,巨桉幼苗接入桉树枝瘿姬小蜂雌蜂,其子代经历了1个世代的生长发育,子代的出蜂数、存活率、雌性比和达标卵量比率与对照相比均下降;子代种群趋势指数随着MeJA浓度增加而减小,其中1.00 mmol·L^-1MeJA处理的桉树枝瘿姬小蜂种群趋势指数为24.13,比对照减少67.33%;1.00 mmol·L^-1MeJA处理的效果最好,达70.98%。

有研究表明,植物在喷施茉莉酸(jasmonic acid,JA)或MeJA时,植株内的防御基因被激活,激发组织产生抗消化和抗营养酶类,以及有毒化合物等物质,抵抗害虫进一步危害^[7],其中PAL、SOD、POD和PPO四种防御酶,TI和CI两种蛋白酶抑制剂与植物的抗虫性密切相关^{[12, 13]}。本试验通过外源MeJA处理后,测定了巨桉幼苗叶片PAL、SOD、POD和PPO四种防御酶和TI、CI两种蛋白酶抑制剂的活性,结果表明,桉叶中4种防御酶和2种蛋白酶抑制剂活性发生明显的变化,表现出外源MeJA的浓度和处理时间有一定的相关性。喷施0.05、0.10、0.50和1.00 mmol·L^-1浓度的MeJA处理24-148 h后,桉叶PAL、SOD、POD和PPO四种防御酶和TI、CI 两种蛋白酶抑制剂活性均有不同程度的变化,表明MeJA诱导巨桉幼苗对桉树枝瘿姬小蜂的抗性可能与其提高相关防御酶和蛋白酶抑制剂活性有关。

吕要斌等^[8]和桂连友等^[17]研究表明,MeJA作为诱导植物产生各种抗逆性的特异性化合物,可对昆虫生长造成抑制和拒食效应,引起植食性昆虫营养不良,或干扰昆虫免疫应答和蜕皮过程,阻碍其生长发育,甚至导致死亡。本试验结果表明,MeJA可对桉树枝瘿姬小蜂的出蜂数、产卵刻痕数、存活率、雌性比和种群趋势指数等生长发育和繁殖力指标造成一定的影响,其中1.00 mmol·L^-1MeJA处理的桉树枝瘿姬小蜂种群趋势指数为24.13,比对照减少67.33%;不同浓度MeJA可对桉树枝瘿姬小蜂产生不同的防治效果,其中1.00 mmol·L^-1MeJA处理的防治效果最好,达70.98%。因此,喷施MeJA可作为防治桉树枝瘿姬小蜂的一种技术措施,苗期防治效果极好。