金花茶(Camellia nitidissima Chi)是山茶科(Theaceae)山茶属(Camellia)金花茶组的木本花卉，属国家一级保护植物^[1]，具有较高的观赏与药用价值，其不仅具有山茶科植物中少见的金黄色花朵而且它的各种类型提取物具有抗氧化^{[2, 3]}、降血脂^[4]和抑制癌细胞生长^[5]等作用。体细胞胚是指在离体培养条件下产生的类似于合子胚的离体培养物[6]⁴⁰，金花茶体细胞胚具有再生植株与离体生产药用物质的潜力。相比于传统的扦插、嫁接和分株等植物繁殖方式，植物组织培养增殖系数高、一致性好、条件可控且不受外界环境条件影响等优点[6]⁷。因此,对金花茶体细胞胚进行植物组织培养方面的研究具有理论与现实意义。植物液体培养是指在不添加凝固剂并不断摇动的培养基中对植物或其部分进行的离体培养。它是组织培养的常用方式之一，且具有增殖系数高和材料一致性好的特点。目前，虽然已有关于金花茶体细胞胚增殖方面的报道但缺少对液体悬浮震荡培养过程中金花茶体细胞胚增殖的系统研究^{[7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14]}。因此文中在液体培养过程中先后研究了碳源组合、添加脯氨酸浓度及培养基体积与接种量对金花茶体细胞胚增殖的影响，希望通过以上试验获得大量性状一致的金花茶体细胞胚从而为金花茶体体细胞胚的开发利用提供基础。

试验所用金花茶体细胞胚由福建农林大学园艺植物生物工程研究所提供。以40 g·L^-1 MS+蔗糖+20 g·L^-1山梨醇为培养基，每30 d对体细胞胚进行继代培养。

以MS为基本培养基，采用单因素试验设计，研究在液体悬浮震荡培养过程中碳源组合(40 g·L^-1蔗糖+20 g·L^-1山梨醇、40 g·L^-1蔗糖+20 g·L^-1甘露醇、60 g·L^-1蔗糖)对金花茶体细胞胚增殖的影响。每个处理重复3次，每个重复接种3瓶，30 d后统计增殖系数(增殖系数=培养后体细胞胚的鲜重/接种时的鲜重)并观察体细胞胚的形态(下同)。

以MS为基本培养基，以1.2.1 的最佳结果为碳源，采用单因素试验设计，研究在液体悬浮震荡培养过程中添加脯氨酸浓度(0、2、4 g·L^-1)对金花茶体细胞胚增殖的影响。

以MS为基本培养基，以1.2.1 的最佳结果为碳源，以1.2.2的最佳结果为添加脯氨酸浓度，采用两因素三水平完全随机试验设计，研究在液体悬浮震荡培养过程中培养基体积(15、30、45 mL)、接种量(0.5、1.0、1.5 g)及两者的交互作用对金花茶体细胞胚增殖的影响。

以型号为TLD 30W/54-765的日光灯为光源，光照强度为2 000 lx，光照时间为12 h·d^-1，培养温度为(25±2) ℃，摇床转速为110 r·min^-1，培养基pH在高压灭菌(121 ℃，20 min)前调节为5.8，以200 mL锥形瓶为培养容器，若无特殊说明，培养基体积为30 mL且接种量为0.5 g。

采用SPSS19.0软件对数据进行处理间显著性差异分析与各因素主效应检验。

由表1可知，不同碳源组合处理下金花茶体细胞胚的增殖系数无显著差异。主效应检验结果表明，在液体悬浮震荡培养过程中碳源组合对金花茶体细胞胚增殖系数无显著影响。TC1处理的体胚颜色黄红相间、结构正常且生长旺盛(图1A)；TC2处理的体胚颜色为黄红相间或黄色且少量畸形(图1B)；TC3处理的体胚颜色为黄红相间或黄色且部分畸形(图1C)。因此，TC1(40 g·L^-1蔗糖+20 g·L^-1山梨醇)为金花茶体细胞胚增殖的适宜碳源组合。

	图 1 不同碳源组合处理下培养30 d的体细胞胚 Fig.1 Somatic embryos cultured under different carbon source combination treatments for 30 days 注：A. 40 g·L-1蔗糖+20 g·L-1山梨醇；B. 40 g·L-1蔗糖+20 g·L-1甘露醇； C. 60 g·L-1蔗糖。 Note:A. 40 g·L-1 saccharose +20 g·L-1 sorbitol; B. 40 g·L-1 saccharose +20 g·L-1 mannitol; C. 60 g·L-1 saccharose.
图选项

由表2可知，在 TC1A处理下的金花茶体细胞胚增殖系数最高且与其他2个处理均存在极显著差异。主效应检验结果表明，添加脯氨酸浓度对金花茶体细胞胚增殖有极显著影响。观察发现，3个处理下的体细胞胚形态上无显著差异(图2)。因此，金花茶体细胞胚增殖的适宜添加脯氨酸浓度为2 g·L^-1。

	图 2 不同浓度脯氨酸处理30 d的体细胞胚 Fig.2 Somatic embryos treated by different proline content for 30 days 注:A. 0 g·L-1；B. 2 g·L-1；C. 4 g·L-1。
图选项

由表3可知，在TZJ7与TZJ8处理下的体细胞胚的增殖系数最高且与其他7个处理均存在极显著差异。9个处理下的体细胞胚形态上并无太大差异(图3)。培养30 d后，处理TZJ1、TZJ2与TZJ3的容器中几乎消耗殆尽；处理TZJ4、TZJ5与TZJ6的容器中剩少量液体。主效应结果表明，在液体悬浮震荡培养过程中，培养基体积与接种量及其相互作用均对金花茶体细胞有极显著影响且其影响次序为：培养基体积>培养基体积×接种量>接种量，因此TZJ7与TZJ8均为最佳处理。在体细胞胚储备较少时选用TZJ7,在体细胞胚储备较为富余时选择TZJ8。

图 3 不同培养基体积与接种量下培养30 d的体细胞胚 Fig.3 Somatic embryos in different medium volumes and initial inoculum treatments for 30 days 注：A，B，C培养基体积为15 mL，接种量分别为0.5，1.0，1.5 g；D，E，F培养基体积为30 mL，接种量分别为0.5，1.0，1.5 g；G，H，I培养基体积为45 mL，接种量分别为0.5，1.0，1.5 g。 Note: medium volumes of A, B, C are 15 mL with inoculation amount 0.5, 1.0, 1.5 g respectively; medium volumes of D, E, F are 30 mL with inoculation amount 0.5, 1.0, 1.5 g respectively; medium volumes of G, H, I are 45 mL with inoculation amount 0.5, 1.0, 1.5 g respectively.

图选项

相比于单纯蔗糖或蔗糖与甘露醇组合，以蔗糖与山梨醇的组合作为碳源时体细胞胚结构正常且生长旺盛，林莉^[9]在固体培养过程中也得到类似的结论。HASHIMOTO et al^[15]在小鼠胚胎离体培养过程中发现：培养基中加入过多的葡萄糖会显著提高小鼠胚胎的畸形率且畸形率的提高与胚胎中的山梨醇的含量并无密切关系而与肌醇含量的减少有关。因此，蔗糖与山梨醇的组合适合于金花茶体细胞胚增殖的可能原因是：山梨醇在维持渗透压与提供能量过程中不会影响胚胎的正常生长。

添加脯氨酸比不加脯氨酸更有利于金花茶体细胞胚增殖且添加2 g·L^-1的效果优于添加4 g·L^-1，结果大体与彭艳华等^[8]的报道一致但最佳的添加量存在差异，这可能与材料状态的差异有关。外源氨基酸促进植物胚胎生长的现象在苜宿^[16]、小麦^[17]、可可^[18]、水稻^[19]、番石榴^[20]和库都粟^[21]上均有报道。此外也有关于外源氨基酸促进羊合子胚^[22]与猪合子胚^[23]生长的报道。目前关于外源氨基酸对胚胎生长促进的作用机理尚不清楚，仅GARDNER et al^[22]通过放射性元素标记与核磁共振技术发现：外源氨基酸对苜宿胚胎生长的促进作用不是通过提供合成蛋白的原料这一途径发生的。

在液体培养过程中，培养基体积的多少决定液体培养基中材料的运动情况、材料与氧气的接触情况及养分的多少。若在液体培养过程中容器中的液体培养基过少，则离体培养的材料会与瓶璧产生剧烈的摩擦且在培养后期会出现养分不足的现象。因此在金花茶体细胞胚液体悬浮震荡培养过程中容器中的液体不宜过少。

目前，对金花茶的开发主要集中在活体叶片与花朵上而缺少对金花茶离体培养材料的开发利用。试验筛选出的培养基与接种密度能够为这方面的研究提供大量性状一致的体细胞胚。此外初步研究表明，试验所使用的体细胞胚中多酚与儿茶素含量分别约为20.68和5.09 mg·g^-1。因此开展金花茶体细胞胚多酚离体生产具有广阔的发展前景。