毛稔(Melastoma sanguineum Sims.)是野牡丹科(Melastomataceae)野牡丹属(Melastoma)的一种常绿大灌木^[1]，其植株挺拔，花大色艳，是优良的园林观赏植物，可作庭园孤植树或行道树，观赏效果良好^{[2, 3, 4]}。野牡丹属植物种子极小，发芽率不高，发芽周期多在1个月左右^[5]。目前，对毛稔的研究主要集中在药理作用^[6]、无性繁殖^{[2, 5]}及种间杂交^[7]等方面，而组织培养快速繁殖技术研究相对较少，仅何长信等^[8]利用毛稔种子进行组织培养，发现6-苄氨基腺嘌呤(6-benzylaminopurine,6-BA)对毛稔不定芽繁殖有显著影响。采用离体组织培养技术建立毛稔再生体系，可以缩短繁殖周期，提高繁殖系数及整齐度。本课题组对毛稔叶片离体培养与植株再生进行试验，旨在建立高效、优良的毛稔繁殖体系并探索适合毛稔叶片离体培养的优化条件，为其快速繁殖提供参考，对推动毛稔的广泛应用有重要意义。

外植体来自福建农林大学园林学院组培实验室的毛稔无菌苗。培养温度为(25±1) ℃，光源为日光灯，光照强度1 800-2 500 lx。

试验采用L₉(3⁴)正交设计。选取长势一致的顶生新叶，切成0.5-1 cm²大小，叶背朝上接种于添加不同浓度6-BA、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-dichlorophenoxyacetic acid,2,4-D)、萘乙酸(1-naphthaleneacetic acid,NAA)(表 1)的MS培养基(蔗糖30 g·L^-1，琼脂6.5 g·L^-1，pH=5.8)中，对照组(CK)为不添加任何激素的MS培养基。将9个处理及对照组放于3个不同光照(0、6、12 h·d^-1)条件下进行培养，20 d后全部转移至同一光照条件下(12 h·d^-1)。每瓶接种外植体5个，每个处理10瓶，2个重复。40 d后统计愈伤组织的诱导率。

利用 1.2.1 最佳诱导培养基诱导出的愈伤组织作为接种材料，将生长良好的愈伤组织切成0.5 cm²大小的小块，转接至以MS培养基(蔗糖30 g·L^-1，琼脂6.5 g·L^-1，pH=5.8)为基本培养基、添加不同浓度6-BA、NAA的分化培养基中，每瓶接种5个，每个处理6瓶，2次重复。30 d后统计愈伤组织分化率，筛选出最佳的分化培养基。愈伤组织分化培养基激素配比见表 2。

利用 1.2.2 最佳分化培养基分化出的不定芽作为接种材料，在原培养基上继代增殖15 d后，挑选长势一致的不定芽接种在添加不同浓度NAA的MS、1/2 MS培养基(蔗糖30 g·L^-1，琼脂6.5 g·L^-1，pH=5.8)中进行生根培养。每瓶接种3个茎段，每个处理15瓶，2次重复。培养40 d后，统计生根率，筛选出最佳的生根培养基。生根培养基见表 3。

将组培苗移出培养室，每隔3 d将瓶口逐步打开，早晚喷雾，保证一定湿度。炼苗9 d后，从培养瓶取出幼苗，用清水清洗幼苗并去掉部分须根，移栽到1/4黄心土+1/4沙土+1/2泥炭土(体积比)经过高压灭菌的基质中，放在温室大棚中，每天浇水1次，30 d后统计移栽成活率。

参考伍成厚等^[9]的方法计算愈伤组织诱导率和愈伤组织分化率，参考段超^[10]的方法计算生根率。用Excel软件进行图表分析，用SPSS软件对试验数据进行显著性分析和多重比较。

毛稔叶片在添加不同激素的培养基培养5 d后叶片开始反卷，10 d后由边缘切口处开始往叶片中部形成小球状愈伤组织；不添加任何激素的MS培养基中的叶片无法形成愈伤，最后干枯、死亡。通过观察发现，黄白色愈伤组织结构较松散，在后期生长中容易出现玻璃化，黄绿色的愈伤组织结构致密。个别愈伤组织在32 d时出现褐化，无法分化出不定芽。同时，个别愈伤组织出现红色斑点，且不断扩大，这类愈伤组织无法分化出不定芽，这种现象在野牡丹科植物组织培养中未见报道。

光照条件下毛稔叶片愈伤组织开始形成的时间为10 d，黑暗条件下叶片接种15 d后开始形成愈伤组织。黑暗条件下形成的愈伤组织结构松散，后期生长状况较好，颜色为黄绿、黄绿偏白，光照条件形成的愈伤组织颜色多为黄绿色，但容易出现褐化。不同光照条件下愈伤组织诱导率差别较大，黑暗条件平均诱导率为68.44%，光照6 h·d^-1的平均诱导率为54.67%，光照12 h·d^-1的平均诱导率为77.0%。第1、2、3、4组在3种光照条件下诱导率差别不大，第4组在黑暗和6 h·d^-1光照条件下诱导率均最高(表 4)。

用LSD法多重比较光照时间对毛稔叶片愈伤组织诱导率的影响，结果表明，6 h·d^-1与12 h·d^-1差异极显著(Sig.=0.000 < 0.01)，与0 h·d^-1差异显著(Sig.=0.020 < 0.05)，0 h·d^-1与12 h·d^-1差异不显著(Sig.=0.075>0.05)。0与12 h·d^-1条件下均有利于毛稔愈伤组织形成，最差的为6 h·d^-1。

对光照12 h·d^-1的9个正交处理组进行极差分析，第4、6组愈伤诱导率与其他各组差异显著，第6组(0.5 mg·L^-1 6-BA+2.0 mg·L^-1 2,4-D+0.1 mg·L^-1 NAA)愈伤诱导率最高，平均为96%，第3组(0.1 mg·L^-1 6-BA+2.0 mg·L^-1 2,4-D+1.0 mg·L^-1 NAA)诱导率最低，平均为55%(表 5)。比较R值显示，3种不同激素对愈伤组织诱导影响的主次关系为6-BA>NAA>2,4-D。通过极差分析得出，在此光照条件下，最适宜毛稔叶片愈伤组织诱导的激素组合为0.5 mg·L^-1 6-BA+2.0 mg·L^-1 2,4-D+0.5 mg·L^-1 NAA。通过组间效应检验，6-BA的Sig.=0.007 < 0.01，2,4-D的Sig.=0.443>0.05，NAA的Sig.=0.017 < 0.05，6-BA对毛稔叶片愈伤组织诱导率的影响极显著，NAA显著，2,4-D不显著。

用LSD法多重比较6-BA、NAA对毛稔叶片愈伤组织诱导率的影响。不同浓度水平的多重比较表明，0.1 mg·L^-16-BA处理与0.5 mg·L^-16-BA处理的差异极显著(Sig.=0.003 < 0.01)，0.1 mg·L^-16-BA处理与1.0 mg·L^-16-BA处理的差异显著(Sig.=0.014 < 0.05)，0.5 mg·L^-1与1.0 mg·L^-16-BA处理差异不显著(Sig.=0.381>0.05)。6-BA浓度为0.5、1.0 mg·L^-1时均有利于毛稔叶片愈伤组织形成，0.1 mg·L^-1效果较差。0.5 mg·L^-1NAA处理与1.0 mg·L^-1NAA处理差异极显著(Sig.=0.007 < 0.01)，0.1 mg·L^-1与1.0 mg·L^-1差异显著(Sig.=0.026 < 0.05)，0.1 mg·L^-1与0.5 mg·L^-1差异不显著(Sig.=0.476>0.05)，NAA浓度为0.1、0.5 mg·L^-1时可促进毛稔愈伤组织形成。

在培养过程中发现，转接至分化培养基的愈伤组织第1周无明显变化，之后缓慢向四周进行增殖，结构逐渐变松散，15 d后开始分化出不定芽，芽体细弱。无法分化的愈伤组织逐渐褐化、死亡。

分化培养终期有6个处理组的愈伤组织已经分化出不定芽，但分化率不高(表 6)，第7组培养基(MS+2.0 mg·L^-1 6-BA+0.1 mg·L^-1 NAA)分化不定芽最多，平均分化率10%，其次为第8组，即MS+2.0 mg·L^-1 6-BA+0.2 mg·L^-1 NAA，平均分化率6.67%，1、2、6组均未分化。通过主体间效应检验发现，6-BA对分化率有显著影响(Sig.=0.042 < 0.05)。用LSD法多重比较不同浓度水平6-BA对毛稔愈伤组织分化的影响，结果表明，6-BA浓度为2.0 mg·L^-1时与0.5 、1.0 mg·L^-1时差异显著(Sig.=0.012 < 0.05，Sig.=0.043 < 0.05)，0.5 mg·L^-1与1.0 mg·L^-1差异不显著(Sig.=0.515>0.05)。

不定芽接种3 d后，基部伤口出现小团乳白色愈伤组织，6 d后第4组开始长出不定根，7 d后第2组开始长出不定根，其余各组从第8 d开始陆续长出不定根，根尖红色，随着根继续生长，红色变淡但不会消失。6组生根培养基的生根率相差不大(表 7)。MS+0.5 mg·L^-1 NAA的生根率最低(70.56%)，第4组生根率、生根数、平均根长均达到最大，生根率为88.89%。毛稔生根的最佳配方为处理4：1/2 MS+0.1 mg·L^-1 NAA 。

炼苗后组培苗成活率达92%，移栽到1/4黄心土+1/4沙土+1/2泥炭土的基质中，30 d后移栽成活率达89.13%。

研究表明，黑暗培养有利于诱导愈伤组织^{[11, 12]}。马国华等^[13]以多花野牡丹(M. affine D. Don.)和野牡丹(M. candidum D. Don.)的嫩叶为外植体，黑暗培养2周后形成黄绿色的愈伤组织，但无法观察到芽的形成。本课题组通过比较3种不同光照条件的愈伤组织诱导率发现，黑暗和12 h·d^-1光照均能有效地诱导毛稔愈伤组织的形成，但12 h·d^-1光照下愈伤容易褐化，黑暗条件下形成的愈伤后期生长较好。在毛稔叶片愈伤组织诱导中，可以采用一定时间的黑暗培养。

MS培养基对多花野牡丹、地菍(M. dodecandrum Lour.)、毛稔均适合^[14]。分裂素及生长素影响植物组织培养方向，分裂素促进细胞分化与不定芽的发生，常用的分裂素为6-BA，浓度0.5-3.0 mg·L^-1，生长素主要促进细胞生长、伸长及根的发生，生长素多用0.05-1.0 mg·L^-1 NAA^{[15, 16]}。通过正交试验发现，6-BA对毛稔叶片愈伤组织形成的影响最大，其次是NAA，2,4-D对其影响最小，12 h·d^-1光照下适宜愈伤组织诱导的培养基为0.5 mg·L^-1 6-BA+2.0 mg·L^-1 2,4-D+0.1 mg·L^-1 NAA，这与伍成厚等^[9]的研究结果相似。出现红色愈伤组织的现象在野牡丹属植物组织培养中未见报道，这可能与激素浓度配比或光照时间有关。

植物愈伤组织分化受基因型、外植体的影响，常用的外植体为茎尖、幼嫩茎段，而叶片、花器官分化效果较差^[16]。选择合适的培养基、激素、光照、温度等外界因素可以改善分化状况。梁钾贤等^[17]发现，光质对甘蔗(Saccharum officinarum L.)愈伤组织分化影响显著，分化效果为红光>白光>蓝光，本试验未对光质进行探究，采用日光灯源。6-BA对毛稔愈伤组织分化有显著影响，分化过程中一定浓度分裂素结合低浓度的生长素才能在实现分化的同时又满足愈伤组织继续生长的需求，试验筛选出适宜毛稔愈伤组织分化的培养基为MS+2.0 mg·L^-1 6-BA+0.1 mg·L^-1 NAA ，这与胡松梅等^[18]、蒋道松等^[19]的愈伤组织分化的研究结果较一致，均以较高浓度的6-BA结合低浓度的NAA为最佳激素浓度组合。在毛稔不定芽生根试验中发现，低浓度无机盐可提高生根数，低浓度NAA促进根的发生，不定芽生根的最佳配方为1/2 MS+0.1 mg·L^-1 NAA，这与角茎野牡丹(Tibouchina granulose Cogn.)^[20]生根试验的结果相似。