上海崇明岛地处长江入海口，岛内河网密布，蕴含丰富的鱼类资源。过去已有研究围绕崇明岛鱼类多样性这一方向开展^[1-3]，但这些研究中，都仅利用撒网、拖网等传统捕捞方法进行。某些鱼类具有隐蔽性强、昼伏夜出等生活习性，使得其难以被捕获。因此，单一利用传统捕捞方法调查鱼类组成具有一定的局限性，不一定能充分揭示研究区域的种类组成。

环境DNA(eDNA)是指从环境样本中提取到的DNA片段，是来自微生物、动物、植物等不同物种DNA的混合物^[4]。通过不同的DNA宏条形码，扩增环境样本中特异的DNA片段，用以检测环境中物种种类和数量的技术称为eDNA技术。近年来，eDNA技术以其灵敏度高、省时高效等特性在物种监测方面得到广泛应用：王晨等^[5]利用eDNA技术调查了秦淮河鱼类资源；ALAM等^[6]在韩国4条河流发现了多种入侵鱼类；徐念等^[7]在长江中下游检测出长江江豚序列。还有其他水生生物的研究^[8-14]应用eDNA技术，得到了传统方法未能获得的信息。目前，已有较多研究将eDNA技术应用于长江流域鱼类多样性研究中^{[5, 7-8, 15-16]}，但尚无关于崇明岛鱼类多样性的研究。另外，崇明岛内河存在违规捕捞现象，破坏了鱼类资源^[17]。为实现“长江十年禁渔计划”及“崇明世界级生态岛”发展目标，在崇明岛开展全面的鱼类多样性调查十分有必要。本研究以崇明岛内河为调查区域，利用eDNA宏条形码技术结合传统捕捞技术，探究崇明岛内河鱼类资源及多样性，以期为“长江十年禁渔计划”及“崇明世界级生态岛”建设的水环境治理和鱼类多样性保护提供参考。

1 材料与方法 1.1 样品采集及处理

在崇明岛2条市级河道(南横引河、北横引河)、数条县级河道、镇级河道、村级河道设置24个采样位点(图 1)。于2020年6月至2021年5月期间，春季(2021年5月25日至28日)、夏季(2020年6月28日至7月4日)、秋季(2020年10月6日至8日)、冬季(2021年1月30日至2月2日)各进行一次采样工作。对于传统捕捞方法采样：每个位点放置2张刺网(100 m长2指宽、100 m长4指宽)及2个地笼，放置时间为2 h。在获得位点鱼类标本后，首先拍摄样本照片，随后将样本装入密封袋并写上采样点信息，放入便携式冰箱，带回实验室鉴定。eDNA调查方法：每个位点采集河道表层、中层、底层(每个水层断面左、中、右)水样共10 L，混匀后取3 L水样进行现场真空抽滤。抽滤使用3 μm孔径的聚碳酸酯滤膜(GVS公司)对eDNA进行截留，每张滤膜过滤1 L水样，同时每个采样点均抽取1 L蒸馏水作为空白对照。为避免交叉污染，过滤器和手套均为一次性，在每个样点采样后丢弃。抽滤前，抽滤装置均用84消毒液润洗1次，再用采样点的水样润洗3次。抽滤完成后将滤膜保存至装有700 μL CTAB溶液的无菌无酶的2 mL离心管中，放至便携式冰箱储存(冰箱温度控制在0~4 ℃)，直至带回实验室进行DNA提取。

1.2 形态鉴定及分类

鱼类样品在鉴定前用自来水清洗掉表面泥沙污垢，然后根据《中国动物志：硬骨鱼纲鲈形目-虾虎鱼亚目》^[18]、《中国动物志: 硬骨鱼纲鲤形目(中卷)》^[19]、《长江口鱼类》^[20]对样品进行鉴定、分类，记录各物种样本数。

1.3 eDNA提取、扩增及测序

eDNA的提取基于酚氯仿DNA提取法原理，作出了一些修改。首先将离心管在65 ℃下加热10 min，随后向离心管内加入氯仿-异戊醇混合溶液(24∶1)，涡旋振荡5分钟后在15 000 g下离心15 min，将上清液移入新的无菌无酶的2 mL离心管中，再依次加入500 μL冰镇异丙醇、250 μL浓度为5摩尔质量的氯化钠溶液，放入-20 ℃冰箱冷冻1小时。冷冻后取出，在15 000 g下离心15分钟，轻轻倒出废液。加入150 μL 70%乙醇，在15 000 g下离心5 min，轻轻倒出废液，再次加入150 μL 70%酒精及在15 000 g下离心5 min。倒出废液后，在真空离心空干机中以45 ℃空干10 min。最后加入100 μL TE缓冲液，在55 ℃下加热10 min，得到eDNA溶液。

对于同一样点的3份水样，首先将提取出的eDNA溶液混成1管，然后分出3个平行管，再而利用MiFish鱼类通用引物^[21-22](表 1)进行PCR扩增。扩增体系与测序文库构建方法一致遵循MIYA等^[22]所描述，同一样点的3个平行采用同一组测序接头索引序列以方便后续总结每物种的序列数。空白对照的实验操作与样品一致。测序平台为Illumina NovaSeq PE150(北京诺禾致源科技股份有限公司)。

1.4 数据分析

将原始测序数据去除测序接头，上传至MiFish Pipeline^[23]网站(http://mitofish.aori.u-tokyo.ac.jp/mifish)进行一站式分析，过程包括序列组装、引物去除、数据库序列比对。使用的序列比对数据库为MitoFish数据库^[24]，eDNA序列与数据库序列相似度阈值设置为97%，即eDNA序列与数据库序列有≥97%相似度时，记录该eDNA序列及数据库序列对应的物种名称，以此得到利用eDNA技术检测出的物种信息。将各位点同种鱼类序列数相加得到该种的总序列数。最后，分别基于捕获鱼类个体数、eDNA检出鱼类对应的总序列数，计算4个季节和全年的香农-威纳(Shannon-Wiener)多样性指数，并采用McNaughton优势度指数确定优势种。指数计算公式如下：

式中：N为所捕获鱼类总个体数或序列数，N_i为第i种鱼类的个体数或序列数，Y_i为第i种鱼类的优势度指数(Y_i> 0.02的物种为优势种)，f_i为第i种鱼类出现的频率。

基于eDNA检出结果，使用R语言中的vegan、ape包对24个采样位点进行主坐标分析(PCoA)。然后根据24个采样位点的采样位置进行分组，一组为南支(位点1、5、8、9、15、16、18、20)、北支(位点3、4、7、14、22、24)、竖河(位点2、6、10、11、12、13、17、19、21、23)，另一组为西部(位点1、2、3、4、5、6、7)、中部(位点8、9、10、11、12、13、14、15)、东部(位点16、17、18、19、20、21、22、23、24)，分析南支、北支、竖河间以及西部、中部、东部河道间物种组成差异，并利用PERMANOVA检验进行显著性检验。

2 结果 2.1 鱼类组成和多样性

2020年至2021年4次调查，共采集鱼类样本2 095尾，鉴定出38种鱼类(表 2)；eDNA技术检出75种鱼类(表 3)。综合渔网捕获样本种类与eDNA技术检出种类，在崇明岛内河共检出78种鱼类。其中：鲤形目鱼类最多，有34种，占检出物种数的44%；鲈形目次之，有24种，占检出物种数的31%；鲇形目有4种，占检出物种数的5%；鲻形目、鲀形目都各有3种，各占检出物种数的4%；鲱形目、鲑形目各有2种，各占检出物种数的3%；鳗鲡目、鲹形目、鲽形目、颌针鱼目、鳉形目、合鳃鱼目都仅有1种，各占检出物种数的1%。

基于捕获的鱼类样本种类和数目，计算得到春季的Shannon-Wiener多样性指数为2.33，夏季为1.82，秋季为2.34，冬季为2.49，全年为2.08。全年优势种为子陵吻虾虎鱼、似鳊、鳊、麦穗鱼、大鳍鱊、中华鳑鲏(表 2)。基于eDNA检出的鱼类序列数，计算得到春季的Shannon-Wiener多样性指数为2.78，夏季为2.45，秋季为3.17，冬季为2.71，全年为2.96。全年优势种为刀鲚、子陵吻虾虎鱼、斑尾刺虾虎鱼、鲫、鲢、鳙、细鳞鲴、似鳊、鳊、达氏鲌、蒙古鲌、麦穗鱼、大鳍(表 3)。

2.2 鱼类种类组成区域差异

使用PCoA将数据降为二维，PCo1和PCo2两个主坐标共解释24.3%的差异。在PCoA图中，无论在南支、北支、竖河组(图 2)或西部、中部、东部组(图 3)中，组内各小组重叠较多，没显著分开。PERMANOVA检验结果(表 4)表明：南支、北支、竖河组间可解释部分(R²)较小，无显著差异；东部与西部组间R²最大，两组间鱼类种类组成存在差异；其余组间鱼类种类组成无显著差异。

3 讨论 3.1 崇明岛内河鱼类多样性

在α多样性上，本调查除了检出常见的淡水鱼类，如鲫、草、鲤等，也检出了洄游鱼类，如鳗鲡(降海洄游)、刀鲚(溯河洄游)等；近海鱼类，如鲻、、中国花鲈等；海洋鱼类，如大黄鱼、等。崇明岛内河河网水体为“闸控型”，长江水从南部闸口流入，北部闸口流出^[25]，而近年又出现崇明岛北支盐水倒灌加剧^[26]，水体环境为咸淡水，为淡水、洄游、近海鱼类、海洋鱼类同时存在提供条件。另一方面，依据Shannon-Wiener指数的评价标准^[27]，2 < H′≤ 3表明物种较丰富。基于鱼类个体数和eDNA序列计算的全年Shannon-Wiener指数均在此区间中，表明整体上崇明岛内河鱼类资源仍处于较为丰富阶段。检出的鱼类与张涛等^[2]在2004—2006年、从婷婷等^[3]在2018年捕获的鱼类种类基本相同，表明近年崇明岛内河鱼类种类数处于较为稳定状态，而本研究利用eDNA技术，更检出了以往未被捕获的鱼类物种，进一步揭示了崇明岛内河鱼类种类多样性。另外，基于eDNA序列计算结果显示，春、秋两季的H′值较夏、冬两季高。基于鱼类个体数计算结果也显示春季的H′值高于夏季，然后在秋季增大。而长江口是许多鱼类的产卵场、育幼场和索饵场，产卵群体多在5月达到盛期，索饵群体多在6—8月达到盛期^[20]。同时，大多数鲤科鱼类的繁殖产卵季在4—6月^{[20, 28]}。H′值在春、秋两季的上升，可能是由于产卵群体和索饵群体从长江口进入崇明岛和内河淡水鱼类繁殖增长所致。在β多样性上，PCoA和PERMANOVA分析表明，种类分布差异主要出现在东-西组间。造成此结果的原因可能是崇明岛内河自西向东盐度具有差异^[29]，可容纳的鱼类种类不相同；其次，崇明岛东部发展着重生态保护，西部生产方式以种植业、渔业为主，西部相较于东部渔业捕捞压力大，造成鱼类资源相较于东部少。

优势种是指对群落结构和群落环境的形成有明显控制作用的物种^[30]。两种方法计算出的共同优势种为鳊、似鳊、麦穗鱼、子陵吻虾虎鱼、大鳍，均为杂食性淡水鱼类，表明崇明岛内河鱼类群落结构仍然由淡水鱼类主导，并且可能由于杂食性鱼类的营养来源更多，更容易成为优势种。另一方面，麦穗鱼对水质污染较敏感，被认为可用作环境污染的指示物种^[31]，麦穗鱼为本次调查中的优势种，也侧面反映崇明岛内河水环境治理成效。但值得注意的是，大鳍也是优势种之一，有研究表明：大鳍通过排泄影响水体悬浮有机物含量从而降低水体透明度，并且会促进蓝藻成为浮游植物群落中的优势种，被认为对水环境有负面影响^[32]，后续的水环境治理应关注此物种在河道中的丰度。

3.2 eDNA技术与传统捕捞法的比较

本调查中，刺网/地笼捕获种类与eDNA技术检出种类相差43种，eDNA未检测到传统捕捞法获得的3种鱼类：弹涂鱼、波氏吻虾虎鱼、蛇。仅eDNA技术检出的鱼类为圆尾拟鲿、红鳗虾虎鱼、孔虾虎鱼、中华乌塘鳢、乌鳢、泥鳅、中华刺鳅等底层鱼类，其中孔虾虎鱼、中华乌塘鳢都栖息于洞穴或水体底层、在崇明野生资源较少^{[20, 33]}；乌鳢生活在沿岸底泥水草丛生区^[34]；泥鳅生活在水体底层，水温过高或过低时会潜入底泥中^[35]；中华刺鳅栖息于有水草的岸边底层，白天一般潜伏在水底^[36]。此4次调查均在白天时间进行，最晚不过晚上7时。考虑到在每个位点布置的刺网出现“刺网挂底”现象的可能性，每张刺网均尽量不触及河床。地笼一般放置过夜，但因考虑到采样的效率和安全性，本研究中地笼在每个采样点都仅放置2 h。另外，传统捕捞法也没有捕获例如食蚊鱼、间下等小型中上层鱼类。考虑到网眼孔径太小无法捕获中大型鱼类的问题，本研究使用的刺网网眼孔径最小为2指，因此无法捕获食蚊鱼这类小型中上层鱼类。以上原因造成了本调查利用传统方法采样的一些缺陷：无法捕获个体小、隐蔽性强、昼伏夜出的鱼类物种。利用eDNA技术，可以弥补这些缺点，检测出传统方法难以采集到的物种。尽管如此，对于某些近海鱼类及所有海洋鱼类，本调查均没有采集到实体。先前有研究^[37]指出，eDNA可随着水流漂移，因此，利用eDNA技术检出的海洋鱼类DNA可能是从崇明岛外围长江口海域漂入，个体在崇明岛内河道并不存在。此外，eDNA技术还检出了非本地鱼类：尼罗罗非鱼、大口黑鲈，这两种鱼类在国内均为水产养殖品种，在崇明岛内河中检出，可能采样点附近存在水产养殖场、饭店或居民住宅，由于个别个体从养殖场逃逸，养殖场、饭店或居民住宅直接排放废水到内河环境，养殖鱼类的DNA随废水进入内河，随后DNA在采样点被采集检出。这些因素都会造成对本地真实鱼类多样性的误判。

3.3 eDNA技术在鱼类多样性调查中的作用

eDNA技术检测鱼类多样性的原理是利用特定引物扩增鱼类序列，然后根据扩增的序列再比对到数据库上已有的序列，得出检出鱼类物种。但由于引物特性，某些鱼类物种序列无法被扩增，或者数据库的不完整性，扩增出的序列无法对比数据库已知序列中，这两种原因都会导致eDNA结果的“假阴性”。目前，已有针对eDNA采样与分析流程优化的研究^[38]。本研究中eDNA技术亦无法检出由传统方法捕获的弹涂鱼、波氏吻虾虎鱼、蛇，这可能由以上两种原因造成。因此，eDNA技术在引物设计等方面还需要进一步完善，而且还需物种序列信息丰富、不断更新完整的数据库支持。

综上，本调查结合传统捕捞法和eDNA技术，揭示了崇明岛内河鱼类种类组成、鱼类物种多样性现状，也侧面反映崇明河道水环境现状。同时，eDNA技术能检测出传统鱼类多样性调查手段难以捕获的物种，可以作为鱼类资源调查的一个重要补充手段。