维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)是中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)细菌性病害的重要病原菌，对中华绒螯蟹养殖危害巨大。姜光明等^[1]研究发现，维氏气单胞菌能够引起中华绒螯蟹败血症，对中华绒螯蟹的最低致死剂量为2.1×10⁴ CFU/g；周慧华等^[2]研究表明，维氏气单胞菌能够使中华绒螯蟹出现肝胰腺坏死、肠炎等病症，对中华绒螯蟹的半数致死剂量为6.92×10⁴ CFU/mL。因此，中华绒螯蟹维氏气单胞菌的控制应予以重点关注。中草药资源丰富，因富含多种抑菌成分而具有良好的杀菌效果，而且不易产生耐药性，具有良好的水产绿色抗菌药物开发价值^[3]。目前，抗鱼源维氏气单胞菌中草药的筛选工作已经取得了较大进展，发现了对花鲈(Lateolabrax maculatus)、黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)、罗非鱼(Oreochromis mossambicus)致病性维氏气单胞菌具有良好抑菌活性的乌梅、苏木、五倍子、丁香、艾叶、石榴皮、地榆、黄芩、五味子等中草药^[4-7]，但从现有文献资料来看，关于抗中华绒螯蟹维氏气单胞菌中草药的筛选及其组方研究却鲜有报道。鉴此，本实验通过试管二倍稀释法分析50种中草药对中华绒螯蟹致病性维氏气单胞菌的抑菌活性，在筛选出潜在抗菌中草药的基础上，采用正交t值法对中草药复方制剂的组方进行了优化，并进一步评价了中草药复方制剂的体外抗菌效果，以期为抗中华绒螯蟹维氏气单胞菌的中草药复方制剂的开发提供技术支撑。

1 材料与方法 1.1 试验材料

50种中草药(表 1)，购自宸瑜中药材；营养琼脂、营养肉汤，购自国药集团(上海)化学试剂有限公司；0.85%氯化钠溶液，由本实验室自制；维氏气单胞菌HXH1，分离自患病中华绒螯蟹肝胰腺^[2]，由本实验室保存；中华绒螯蟹维氏气单胞菌HXY1、HXY3、J1Y4、J1Y5、J2Y4、J2Y6、WAB1，由国家水生动物病原库提供。

1.2 中草药提取液的制备

参照马秀慧等^[7]的方法制备中草药提取液。将供试中草药于60 ℃恒温干燥箱中烘至恒重，各取50 g放进药壶，加500 mL自来水，浸泡30 min后煎煮。其间武火煎煮30 min，过滤第1道药液；药渣加500 mL自来水，文火煎煮60 min，过滤第2道药液；药渣加500 mL自来水，武火煎煮30 min，过滤第3道药液，将3次药液合并后浓缩至50 mL使总药质量浓度达到1 g/mL，121 ℃高压灭菌后，置于4 ℃冰箱保存待用。

1.3 维氏气单胞菌菌悬液的制备

参照李春涛等^[8]的方法进行维氏气单胞菌菌悬液的制备。将斜面保藏的维氏气单胞菌HXH1、HXY1、HXY3、J1Y4、J1Y5、J2Y4、J2Y6、WAB1用接种环接种到营养琼脂平板上，置于37 ℃恒温培养24 h后，取单菌落接种于无菌营养肉汤中，于180 r/min、37 ℃恒温振荡培养18 h，然后无菌操作取培养液100 μL均匀涂布于营养琼脂平板上，置于37 ℃恒温培养24 h后用0.85%氯化钠溶液洗下菌苔制成菌悬液，采用稀释涂布平板法^[9]测定菌悬液的含量，并将菌悬液含量稀释成1×10⁷ CFU/mL。

1.4 优良抗菌中草药的筛选

以维氏气单胞菌HXH1为优良抗菌中草药筛选用目的菌株，采用试管二倍稀释法^[10]分别测定各中草药提取液对维氏气单胞菌的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)。即取10支含2.0 mL无菌营养肉汤的带帽试管，无菌操作于第1支试管中加入2.0 mL中草药提取液使药液质量浓度为1 000 mg/mL，混匀后从中取出2.0 mL加入第2支试管中使药液质量浓度为500 mg/mL，然后依次相同操作稀释至第9支试管使药液质量浓度分别为250、125、62.5、31.25、15.63、7.81、3.91 mg/mL，并从第9支试管取出2.0 mL弃去，然后在9支试管中分别加入维氏气单胞菌菌悬液使菌含量为1×10⁶ CFU/mL，第10支试管作空白对照，不加药液和菌悬液。将10支试管置于28 ℃恒温静置培养24 h后，把无菌生长、稀释度最高的试管中的药液质量浓度作为最小抑菌质量浓度^[11]，每个处理3个平行。

1.5 中草药复方制剂的配伍优化分析

以维氏气单胞菌HXH1为目的菌株，采用正交t值法^[12]对1.4节筛选的7种优良抗菌中草药进行配伍优化，分别进行主药分析、辅药交互分析、剂量优化分析。

1.5.1 主药分析

根据正交t值法组方原则^[12]设计L₁₂(2⁷)正交试验因素水平表(表 2)，并按照各组合水平将各中草药复配并参照1.2节的方法制成质量浓度为1 g/mL的中草药复方制剂，采用试管二倍稀释法^[10]测定各组合水平下制备的中草药复方制剂对维氏气单胞菌HXH1的MIC，确定中草药复方制剂的主药组成。每个处理3个平行。

1.5.2 辅药交互作用分析

根据1.5.1节筛选的中草药复方制剂的主药组成(黄连20 g+香薷20 g)的基础上，设计分析辅药(苏木、乌梅、石榴皮)交互作用的L₈(2³)正交试验因素水平表(表 3)，并按照各组合水平将各中草药复配并参照1.2节的方法制成质量浓度为1 g/mL的中草药复方制剂，采用试管二倍稀释法^[10]测定各组合水平下制备的中草药复方制剂对维氏气单胞菌HXH1的MIC，分析中草药复方制剂中辅药之间的交互作用。每个处理3个平行。

1.5.3 剂量优化分析

根据1.5.1节和1.5.2节进一步确定的中草药复方制剂的主药(黄连、香薷)和辅药(苏木、石榴皮)设计L₉(3⁴)正交试验因素水平表(表 4)，并按照各组合水平将各中草药复配并参照1.2节的方法制成质量浓度为1 g/mL的中草药复方制剂，采用试管二倍稀释法^[10]测定各组合水平下制备的中草药复方制剂对维氏气单胞HXH1的MIC，确定中草药复方制剂中主药与辅药的最佳配伍剂量。每个处理3个平行。

1.6 中草药复方制剂对中华绒螯蟹维氏气单胞菌的体外抗菌效果分析

根据1.5节确定的最佳组合及配伍比例将各中草药复配并参照1.2节的方法制成质量浓度为1 g/mL的中草药复方制剂，并采用试管二倍稀释法^[10]测定中草药复方制剂对维氏气单胞菌HXY1、HXY3、J1Y4、J1Y5、J2Y4、J2Y6、WAB1的MIC。每个处理3个平行。

1.7 数据处理与分析

所有试验数据采用SPSS 11.0软件进行处理分析，以平均值±标准差表示。

2 结果与分析 2.1 优良抗菌中草药的筛选

由表 5可知：黄连、苏木对维氏气单胞菌的抑菌活性最高，其提取液对维氏气单胞菌HXH1的MIC为7.81 mg/mL，其次为大黄、乌梅、鸡血藤、石榴皮、香薷，其提取液对维氏气单胞菌HXH1的MIC均为15.63 mg/mL。五倍子、赤芍、青蒿、虎杖、黄柏、女贞子、地锦草、丹参等8种中草药的提取液对维氏气单胞菌HXH1的MIC为31.25~62.5 mg/mL，地榆、广藿香、玉竹、金樱子、连翘等10种中草药的提取液对维氏气单胞菌HXH1的MIC为62.5~125 mg/mL，苦参、车前草、大青叶、当归、青皮、川楝子等25种中草药的提取液对维氏气单胞菌HXH1的MIC为125~500 mg/mL。因此，优选黄连、苏木、大黄、乌梅、鸡血藤、石榴皮、香薷作为中草药复方制剂配伍优化的候选中草药。

2.2 中草药复方制剂的配伍优化 2.2.1 主药分析

由表 6可知：大黄、鸡血藤的M1＞M2，说明中草药复方制剂中加入大黄、鸡血藤对维氏气单胞菌HXH1的MIC大于不加大黄、鸡血藤的MIC，因此中草药复方制剂中舍去大黄、鸡血藤，最佳组合优选为黄连、苏木、乌梅、香薷、石榴皮。此外，由于中草药复方制剂中加入黄连、香薷对维氏气单胞菌HXH1的抑菌活性较加入苏木、乌梅、石榴皮更高，故将黄连、香薷作为主药，苏木、乌梅、石榴皮为辅药。

2.2.2 辅药交互作用分析

由表 7可知：苏木+乌梅，苏木+石榴皮，乌梅+石榴皮3个中草药组合中{11}＜{12}＜{21}，说明苏木与乌梅、苏木与石榴皮、乌梅与石榴皮3个组合之间存在协同效应。然而，由于乌梅的M1>M2，说明中草药复方制剂中不加乌梅对维氏气单胞菌HXH1的抑菌效果更好。因此，优选苏木、石榴皮作为中草药复方制剂的辅药。

2.2.3 剂量优化分析

由表 8可知：中草药复方制剂的最佳组合为A₂B₂C₃D₁，即黄连50 g、香薷40 g、苏木10g、石榴皮20 g，最佳配伍比例为5∶4∶1∶2。在该配伍比例下制备的中草药复方制剂对维氏气单胞菌HXH1的最小抑菌质量浓度分别为5.21 mg/mL。

2.2.4 中草药复方制剂对中华绒螯蟹维氏气单胞菌的体外抗菌效果

由表 9可知：中草药复方制剂对中华绒螯蟹维氏气单胞菌具有良好的体外抗菌效果。具体表现在：中草药复方制剂对维氏气单胞菌J1Y4、J2Y4的MIC均为3.91 mg/mL，对维氏气单胞菌J1Y5、HXY1、HXY3、J2Y6、WAB1的MIC均为7.81 mg/mL。

3 讨论 3.1 中华绒螯蟹养殖用抗菌中草药的筛选

中华绒螯蟹是我国重要的名特优水产养殖品种，已经成为江苏、湖北、安徽、辽宁等省实施精准扶贫、拉动经济增长、促进农民增收的重要突破口。中草药含有多糖、生物碱、有机酸等活性成分，能够通过抑制细菌细胞壁的合成、破坏细胞膜的完整性和通透性、影响蛋白质和核酸的合成而发挥抑菌杀菌的作用^[13]。因此，利用中草药替代抗生素控制中华绒螯蟹致病菌具有广阔的应用价值和发展前景。目前，我国已经开展了针对中华绒螯蟹腐败希瓦菌(Shewanella putrefaciens)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、温和气单胞菌(Aeromonas sobria)等致病菌的抗菌中草药的筛选工作^[14-16]，但针对中华绒螯蟹维氏气单胞菌的抗菌中草药的筛选却极为薄弱。本研究分析了50种中草药对中华绒螯蟹维氏气单胞菌的抑菌活性，发现黄连、苏木的提取液对中华绒螯蟹维氏气单胞菌的抑菌活性最高，这与夏与晴等^[3]、王洪彬等^[17]的研究观点相同，但对维氏气单胞菌的MIC却与夏与晴等^[3]、王洪彬等^[17]的报道存在差异，可能与菌种来源、中草药产地不同有关^[18]。

3.2 中草药煎煮方法与体外抑菌评价方法的选择

中草药有效成分的提取方法主要有煎煮法、半仿生提取法、超临界萃取法和酶提取法等^[19]。其中，煎煮法是我国最早使用的中草药有效成分的提取方法，因其不需要特殊仪器，简便易行，广泛应用于水产用中草药提取液的制备。夏与晴等^[3]、王宝屯等^[4]、朱成科等^[5]、杨移斌等^[10]、华亚南等^[20]采用煎煮法制备了上百种中草药提取液，在成功评价了中草药对水产动物病原菌的体外抑菌效果的同时，也证实了煎煮法适用于本实验中所有中草药的提取液的制备。因此，本研究选用煎煮法进行了中草药有效成分的提取。此外，中草药体外抑菌活性评价的方法主要有纸片法、平板扩散法和试管二倍稀释法^[21]。其中，试管二倍稀释法不仅可较精细地测定某种药物的药性强弱，还可以观察到同种药物在不同质量浓度下对维氏气单胞菌的抑制和杀伤作用，是分析中草药对维氏气单胞菌抑菌活性的常用方法^[6]。夏与晴等^[3]通过试管二倍稀释法分析了中草药对4种水产养殖致病菌的抑菌作用，证实黄连提取液具有良好的抑菌效果，对嗜水气单胞菌、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)和荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)的MIC分别为31.25、15.63、31.25和31.25 mg/mL；王洪彬等^[17]采用试管二倍稀释法测定了中草药对3种水产动物致病菌体外抑菌效果，发现苏木提取液具有良好的抑菌活性，对美人鱼发光杆菌(Phowbacterium damselae)、嗜水气单胞菌、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)和创伤弧菌(Vibrio vulnifiticus)的MIC分别为62.50、62.50、31.25和7.81 mg/mL。因此，本实验选择试管二倍稀释法测定中草药对维氏气单胞菌的抑菌活性。

3.3 中草药的联合配伍

加强中草药间的协同抗菌研究是提升水产用抗菌中草药制剂应用水平的重要突破口。夏与晴等^[3]将乌梅和石榴皮进行配伍制成复方制剂，发现该复方制剂对嗜水气单胞菌、副溶血弧菌、弗氏柠檬酸杆菌的MIC降低至7.81 mg/mL，较乌梅和石榴皮单用时的MIC(15.63~31.25 mg/mL)显著减少；张文青等^[22]将儿茶、五倍子、五味子、乌梅以4∶2∶4∶1混合制成复方制剂，发现该复方制剂对嗜水气单胞菌的MIC降低至5.86 mg/mL，显著低于儿茶、五倍子、五味子、乌梅单用时的MIC(12.5 mg/mL)。这些研究均揭示了不同中草药之间的适当配伍具有显著的协同抗菌作用^[6]。本实验发现将黄连、香薷、苏木、石榴皮以5∶4∶1∶2配伍制成的复方制剂对维氏气单胞菌HXH1的MIC(5.21 mg/mL)显著低于黄连、香薷、苏木、石榴皮单用时的MIC(7.81~31.25 mg/mL)，而且对其他中华绒螯蟹源维氏气单胞菌菌株也具有良好的体外抗菌效果。究其原因，可能是因为黄连的主要抑菌活性成分是小檗碱^[23]，香薷的主要抑菌活性成分是百里香酚、香荆芥酚^[24]，苏木的主要抑菌活性成分是巴西苏木素^[25]，石榴皮含量最高的抑菌活性成分是鞣质^[26]，四者按适当比例配伍在一定程度上弥补了各自抑菌活性成分单一的缺陷，从而达到了相互补充且协同抗菌作用^[27]。然而，本实验也发现黄连、香薷、苏木、石榴皮在配伍比例不当时的抑菌作用不如黄连单用时明显，这与童国忠等^[28]的研究发现一致。因此，中草药复方制剂在组方设计时要按科学比例严格配伍，以增强其应用的有效性和实用性。