2023,
Vol. 32
2. 上海海洋大学 上海水产养殖工程技术研究中心, 上海 201306;
3. 上海海洋大学 水产动物遗传育种中心上海市协同创新中心, 上海 201306
三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)作为我国重要的育珠贝类[1]，雌雄个体间的产珠性能不同，其中雄性优于雌性[2]。研究性别决定和性腺发育，对三角帆蚌的单性化养殖具有重要的理论基础和实践价值。性激素在动物的性腺发育、性别分化以及功能维持方面发挥重要作用[3-5]。类固醇急性调节蛋白(StAR3)、细胞色素P450(CYP)和羟类固醇脱氢酶(HSD)等酶类可以调节性激素的合成[6-7]。目前在贝类中这方面的研究还不够深入，三角帆蚌中还未见报导。
17β-羟基类固醇脱氢酶(17β-HSD)中除17β-HSD5之外，剩余的14种亚型均属于短链还原脱氢酶(SDRs)家族[8]，SDRs家族基因在氨基酸、类固醇激素、脂类、碳水化合物以及外源代谢中作用显著[9]。典型的SDRs共有4个相对保守的区域：辅助因子结合域(TGxxxGxG)、催化活性位点(YxxSK)、结构稳定域(NAG)和决定反应方向的域(PGxxxT)[10-12]。17β-HSD家族基因在类固醇激素合成中发挥重要作用[13]，同时在性类固醇激素合成的最后过程中起氧化还原作用，催化激素之间的相互转化从而调节体内激素水平的变化[14]。近年来，研究表明17β-HSD参与水生动物的类固醇代谢[15]，同时该家族基因的部分亚型也在软体动物中被逐渐证明可能参与其性激素合成[6-7, 16-18]。17β-HSD11作为17β-HSD家族基因的一种，可以催化雌二醇变为雌酮、睾酮变为雄烯二醇，同时参与脂肪代谢[8]。
本实验在三角帆蚌中通过RACE技术首次克隆了17β-HSD11基因，获得cDNA全长序列。同时通过实时荧光定量技术检测17β-HSD11基因在性腺发育不同组织和不同年龄中的相对表达量。结合在性腺中的定位以及被外源雌激素刺激之后基因表达量的变化来阐明17β-HSD11在三角帆蚌性类固醇激素合成机制中的作用，为三角帆蚌性腺发育和性别分化研究提供理论基础。
1 材料与方法 1.1 实验动物武义伟民水产有限公司养殖基地(浙江省金华市)提供实验所用的三角帆蚌。在上海海洋大学暂养3 d，水温为(26±2)℃。选择个体规格相近的2龄三角帆蚌雌雄各3只，分别采集性腺、闭壳肌、斧足、肝胰腺、外套膜和鳃瓣共6个组织。收集1~8月龄幼贝性腺组织，各个月龄均取样6只。取1、2、3龄雌雄三角帆蚌性腺各3只。上述组织采样后置于液氮中速冻并于-80 ℃保存备用。4%多聚甲醛固定三角帆蚌雌雄性腺组织，2 h后移至70%乙醇中保存备用。
1.2 总RNA的提取及cDNA的合成总RNA的提取使用Trizol法进行，RNA质量与完整性分别使用NanoDrop 2000C(Theemo Scientific，美国)和1%琼脂糖凝胶电泳检测。用Primer ScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒反转录合成cDNA(TaKaRa，日本)。将cDNA稀释5倍使RNA质量浓度变为100 ng/μL，存于-20 ℃备用。
1.3 基因克隆与序列分析根据基因序列用Prime 5.0设计两对引物用于已有序列验证，并设计3′ RACE引物(表 1)。使用5′ /3′ SMARTerTM RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech，美国)反转录特定cDNA和扩增未知序列。产物切胶回收，连接转化，蓝白斑挑菌，送至上海生工有限公司测序。根据WANG等[19]的方法进行序列分析和构建系统进化树。
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表 1 引物名称及序列 Tab.1 Primer names and sequences |
采用Prime 5.0在ORF区设计17β-HSD11基因序列引物，内参基因选择EF1-α (表 1)。使用TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(TaKaRa，日本)进行检测。qRT-PCR反应体系(20 μL)：2× TB Green Premix Ex Taq 10 μL，RNase-free water 6.8 μL，正向和反向引物各0.8 μL，cDNA 1.6 μL。CFX96仪(Bio-Rad，美国)检测基因相对表达量。反应程序：95 ℃ 3 min，95 ℃ 5 s，57 ℃ 30 s，40个循环，65~95 ℃每个循环增加0.5 ℃需5 s。使用2-ΔΔCt法计算17β-HSD11的相对表达量。
1.5 原位杂交石蜡包埋性腺组织，并获得厚度为6~8 μm的组织切片(Leica，德国)。梯度乙醇和二甲苯脱蜡，用于原位杂交实验。根据17β-HSD11基因的cDNA序列设计引物(表 1)。T7 High Efficiency Transcription试剂盒(全式金，北京)及DIG RNA标记试剂盒(Roche Applied Science, Switzerland)用于体外转录和探针标记。之后置于-80 ℃保存备用。使用Enhanced Sensitive ISH Detection kit Ⅱ，AP试剂盒(Boster, USA)进行原位杂交。按照说明书进行操作，之后封片镜检。杂交信号检测和照片拍摄使用徕卡DM 2500显微镜(徕卡，德国)。
1.6 17β-雌二醇注射注射器抽取2龄三角帆蚌性腺辨别雌雄，每组5雌5雄，分3组，进行暂养。3 d后，进行激素注射实验。将17β-雌二醇溶解在无水乙醇中，17β-雌二醇的质量浓度为150和500 ng/μL。每只注射200 μL，质量为30 μg和100 μg。对照组注射同等剂量的无水乙醇。注射48 h后取性腺，置于液氮中，存于-80 ℃进行RNA提取。同时取性腺组织于4%多聚甲醛中用于石蜡切片验证性别。
2 结果 2.1 三角帆蚌17β-HSD11基因的序列分析三角帆蚌17β-HSD11基因cDNA全长为1 134 bp(登录号为OM248660)，其中5′ UTR 40 bp，3′ UTR 171 bp，开放阅读框(ORF)923 bp，编码307个氨基酸。所编码的氨基酸中存在辅助因子结合域(TGxxxGxxG)、催化活性位点(YxxSK)和结构稳定域(NNAG)。见图 1。
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小写字母表示5′ UTR和3′ UTR。大写字母表示编码区(上方为核苷酸，下方为氨基酸)。方框内为起始密码子和终止密码子。阴影部分表示辅助因子结合区；下划线表示结构稳定域；波浪线表示催化活性位点。 Lowercase letters indicated 5′ UTR and 3′ UTR. uppercase letters indicated coding regions (nucleotides above, amino acids below). In the box were the start codon and the stop codon. Shaded areas indicated cofactor binding regions, underline indicated structural stability domain, and wavy lines represent sites of catalytic activity. 图 1 三角帆蚌17β-HSD11的cDAN序列及编码的氨基酸序列 Fig. 1 17β-HSD11 cDNA sequence and encoded amino acid sequence of H. cumingii |
在NCBI中将三角帆蚌的17β-HSD11氨基酸序列和其他物种进行比对，发现三角帆蚌的17β-HSD11序列与九孔鲍(Haliotis diversicolor supertexta)的同源性为58.7%，与葡萄牙牡蛎(Crassostrea angulate)和长牡蛎(Crassostrea giga)的同源性均为58.18%(图 2)。系统进化树如图 3所示，表明17β-HSD11基因与扇贝、牡蛎等贝类聚为一支。
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图 2 17β-HSD11氨基酸的多序列比对 Fig. 2 Multiple comparisons of 17β-HSD11 amino acid |
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节点上的数字表示重复1 000次的Bootstrap检验置信值。 The numbers on the nodes represent the confidence values of Bootstrap test repeated 1 000 times. 图 3 不同物种17β-HSD11氨基酸序列系统进化树 Fig. 3 Phylogenetic tree of 17β-HSD11 amino acid sequence in different species |
17β-HSD11在三角帆蚌雌雄个体中均有表达，不同组织之间表达量存在差异(图 4)。在肝胰腺中表达量最高，雌性显著高于雄性(P < 0.05)。在性腺中，17β-HSD11基因卵巢中的表达量极显著高于精巢(P < 0.01)。在鳃中，雌雄个体之间不存在显著性差异，在外套膜和斧足中，雄性显著高于雌性(P < 0.05)。在闭壳肌中，雄性的表达量极显著高于雌性(P < 0.01)。
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*表示雌雄间存在显著性差异(* P＜0.05，**P＜0.01)。 * indicates significant difference between males and females (*P < 0.05, **P < 0.01). 图 4 不同性别三角帆蚌17β-HSD11在各组织中的相对表达量 Fig. 4 Relative expression of 17β-HSD11 in different tissues of H. cumingii of different sexes |
三角帆蚌17β-HSD11基因在不同发育阶段性腺表达量存在差异(图 5)。在1~3月龄相对表达较高，在4月龄开始下降，到6月龄表达量显著上升(P < 0.01)。在1~3龄三角帆蚌中，17β-HSD11在卵巢的表达量均极显著高于精巢(P < 0.01)，且在2龄中卵巢的表达量最高(图 6)。
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不同小写字母表示各月龄之间存在显著性差异(P＜0.05)。 Different lowercase letters indicate significant differences between different month ages. 图 5 17β-HSD11在早期(1~8月龄) 性腺组织中的相对表达量 Fig. 5 Relative expression of 17β-HSD11 in early (1-8 months of age) gonadal tissues |
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*表示雌雄间存在显著性差异(* P＜0.05，**P＜0.01)。 * indicates significant difference between males and females (*P < 0.05, **P < 0.01). 图 6 17β-HSD11在不同年龄三角帆蚌性腺中的相对表达量 Fig. 6 Relative expression of 17β-HSD11 in gonads of H. cumingii of different ages |
原位杂交结果表明，在雌性性腺中，17β-HSD11基因在滤泡膜、卵膜和卵母细胞(细胞核和细胞质)中存在杂交信号。在雄性性腺中，滤泡膜上存在信号(图版)。
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左侧图像为空白组未加探针，右侧为加探针的实验组。上方为雌性性腺，下方为雄性性腺。Oo.卵母细胞; Fw.滤泡膜; Nu.细胞核。 The left images were from negative controls without Probes, and the right images were obtained using sense Probes. The female gonads are above and the male gonads below. Oo. Oocyte; Fw. Follicular wall; Nu. Nucleus. 图版 17β-HSD11成熟三角帆蚌性腺原位杂交结果 Plate In situ hybridization of 17β-HSD11 in the gonads of mature H. cumingii |
17β-雌二醇分2个质量浓度进行注射，低质量浓度组注射30 μg，高质量浓度组注射100 μg。低质量浓度和高质量浓度注射之后，17β-HSD11基因在三角帆蚌雌雄性腺中的表达量和对照组比均下调。低质量浓度组注射48 h后，17β-HSD11基因在雌性性腺中表达量极显著下调(P < 0.01)，下调33.38%，雄性性腺中显著下调(P < 0.05)，下调37.74%。高质量浓度组中，17β-HSD11基因在雌雄性性腺中表达量均极显著下调(P < 0.01)，在雌性中下调57.78%，在雄性中下调61.31%(图 7)。高质量浓度组中17β-HSD11的下调比低质量浓度组下调得更为明显。
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*表示处理组和对照组之间存在显著性差异(* P＜0.05，** P＜0.01)。 * indicates significant difference between the treatment group and the control group (*P < 0.05, **P < 0.01). 图 7 17β-雌二醇注射后17β-HSD11的相对表达量 Fig. 7 Relative expression of 17β-HSD11 after 17β-estradiol injection |
17β-HSD作为性类固醇激素合成过程中的关键催化酶，是性类固醇激素作用的调节因子[20]。哺乳动物中该家族基因已经有15种被鉴定[21]，该家族基因在部分软体动物中被发现，例如2、4、8、11、12、14亚型，均表明软体动物中可能存在和脊椎动物类似的生物学功能[6-7, 18, 22-24]。本实验首次克隆了三角帆蚌17β-HSD11的cDNA序列全长，发现其编码307个氨基酸。所编码的氨基酸中存在SOD家族的典型结构特征辅助因子结合域(TGxxxGxxG)、催化活性位点(YxxSK)和结构稳定性基序(NNAG)[10-12]，多序列比对结果显示17β-HSD11的序列与无脊椎动物相似度较高，证明17β-HSD11在进化过程中相对保守。
17β-HSD11在各个组织中均有表达，表明该基因在三角帆蚌中可能存在广泛的生物学功能，与其他动物相似[25]。在三角帆蚌雌性性腺中的表达量高于雄性，17β-HSD11在虾夷扇贝中卵巢高于精巢，表现出性二态，在性腺功能维持中作用显著[14]。进一步探讨17β-HSD11在组织中的定位情况，该基因在卵母细胞的细胞核和细胞质上均有明显杂交信号，同时在卵膜和滤泡膜上也存在信号，而在精巢中仅在滤泡膜上有信号。该基因在性腺组织中的定位情况和定量结果高度相似。在紫贻贝卵母细胞发育过程中，17β-HSD11在各个时期均有阳性信号，且与性类固醇激素生物合成关系显著[26]。可见在三角帆蚌中该基因在卵母细胞的发育中也发挥作用。此外，17β-HSD11可以催化脂肪酸的代谢，在肝脏中表达量最高表明可能参与了三角帆蚌脂肪代谢，相似情况在栉孔扇贝和福建牡蛎中均有报导[7, 14, 27]。
2龄蚌中17β-HSD11基因在雌性性腺中的表达量高于1龄，可能是三角帆蚌在1龄时性腺发育未完全，原始生殖细胞处于大量增殖阶段[28]，此时17β-HSD11作为氧化酶催化作用较弱，雌二醇以有活性形式存在，从而促进性腺发育。在2龄时，此时三角帆蚌性腺发育趋于成熟，而成熟生长过程中，17β-HSD11基因在雌性中表达量极显著上升，可能是氧化作用加强，雌二醇被转化为雌酮。在3龄中表达量相对2龄较低，可能是由于3龄时性腺发育成熟，不同的发育时期对17β-HSD11基因也存在影响，在虾夷扇贝、栉孔扇贝中均表明17β-HSD11基因在性腺发育过程中存在类似变化[7, 14]。在雌性中17β-HSD11基因的作用较为明显，说明该基因可能是雌激素合成过程中的关键限速酶，同时在卵母细胞发育过程中发挥重要作用；而在雄性中基因表达呈现上升趋势，较雌性中的作用减弱，说明17β-HSD11可能在睾酮和雄烯二醇二者之间转化的催化能力不强，具体原因有待进一步验证。在太平洋牡蛎中该基因将雌二醇转化为雌酮的能力低于将雌酮转化为雌二醇[29]。在杂色鲍中，17β-HSD11发挥氧化酶作用，将睾酮转化为雄烯二醇，降低雄激素的含量[24]。在早期幼贝性腺发育过程中，17β-HSD11在6月龄表达量最高，而三角帆蚌5~6月龄时进行性别分化[30]，说明其可能在三角帆蚌性别分化过程中发挥重要作用。
性激素在软体动物性腺发育过程中作用显著，外源性激素诱导可能引起性逆转[31]。在脊椎动物中，外源激素可以与相应的受体结合从而影响或者调节激素合成相关基因的表达[32]。以往的研究[33-34]表明，外源性雌二醇抑制StAR3、Cyp17a、17β-HSD等激素合成基因的表达从而取代内源性激素的作用。本实验注射17β-雌二醇之后，17β-HSD11基因的表达量显著下调，在高质量浓度组中下调更为严重，表明该基因受到了雌激素的负调控作用，证实可能在三角帆蚌雌激素合成中发挥重要作用。
绝大多数贝类中关于性激素合成相关基因的研究微乎其微，仅有的研究也仅仅停留在分子鉴定，并未深入研究。本研究首次鉴定了三角帆蚌的性激素合成相关基因17β-HSD11，通过外源雌激素注射三角帆蚌，探究了17β-HSD11基因表达量的变化，为三角帆蚌的性激素合成研究提供基础，17β-HSD11基因可能在三角帆蚌性腺发育、性别分化和雌激素合成中发挥重要作用。研究性激素合成相关基因可以为三角帆蚌性腺发育和性别分化提供一定的理论基础，同时为育珠产业提供一定的生产实践指导。
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