2022,
Vol. 31
2. 上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心, 上海 201306;
3. 食品科学与工程国家级实验教学示范中心, 上海 201306
我国是水产品生产大国，产量呈逐年递增的发展态势。水产品味道鲜美，营养丰富，深受消费者喜爱，然而由于微生物的作用，使其易发生腐败变质，利用率相应降低。水产品流通保鲜多在冷藏条件下进行。现有研究发现，腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)是多种冷藏水产品中的优势腐败菌[1]，其能在低温条件下将三甲胺-N-氧化物还原为三甲胺，参与蛋白质和脂肪分解，生成腐胺、尸胺等，产生臭味，加速水产品的腐败进程[2-3]。因此，抑制腐败希瓦氏菌等优势菌的生长，可降低水产品流通期间的腐损率。
ε-聚赖氨酸盐酸盐(ε-polylysine hydrochloride, ε-PLH)是从淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)受控发酵培养液经离子交换树脂吸附、解吸、提纯而来的一类物质。原国家卫生计生委于2014年发布公告，将ε-聚赖氨酸(ε-polylysine, ε-PL)及其盐酸盐作为食品添加剂新品种[4]，可作为防腐剂用于果蔬、食用菌、粮谷、肉类及制品、调味品与饮料中[5]。相关研究显示，ε-PLH对革兰氏阴性菌和阳性菌作用效果良好，其能使菌体细胞变形，细胞膜完整性丧失，核酸、蛋白质等内容物流失，具有安全、稳定和广谱抑菌性等特点[6]。史文艳等[7]研究发现，ε-PLH主要通过影响ATP酶活性、蛋白质合成与表达及能量代谢过程来影响蜡状芽孢杆菌菌体的生长代谢；李秋莹等[8]研究得出ε-PLH的加入，使壳聚糖和普鲁兰多糖复合涂膜对荧光假单胞菌菌体细胞膜完整性和通透性的破坏增强，降低碱性磷酸酶活性。但目前ε-PLH对腐败希瓦氏菌作用机制还未探明。基于此，以腐败希瓦氏菌为研究对象，通过最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC)和最小杀菌浓度(minimum bactericidal concentration，MBC)测定腐败希瓦氏菌对ε-PLH的敏感度，根据微生物生长曲线推测不同时期细菌的生长情况，结合电导率、碘化丙啶(propidium iodide, PI)摄入量、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKPase)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDHase)和腺苷三磷酸酶(adenosine triphosphatase, ATPase)活性来衡量菌体细胞结构破坏程度，并结合扫描电镜(scanning electron microscope, SEM)观察ε-PLH对菌体形态的影响，初步分析ε-PLH对腐败希瓦氏菌的作用机制，以期为ε-PLH在水产品保鲜中的应用提供理论参考。
1 材料与方法 1.1 实验材料腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)为本课题组前期从腐败暗纹东方鲀中分离、筛选并鉴定后将菌株保存于-80 ℃的超低温冰箱，存放于上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心。
1.2 主要药品试剂ε-聚赖氨酸盐酸盐(ε-PLH)购于浙江新银象生物工程有限公司；AKPase试剂盒、LDHase试剂盒、超微量总ATPase试剂盒均购于南京建成生物工程研究所；胰蛋白胨大豆琼脂培养基(tryptic soy agar, TSA)、胰蛋白胨大豆肉汤(tryptic soy broth, TSB)、氯化钠、无水乙醇、戊二醛购于国药集团化学试剂有限公司，均为国产分析纯。
1.3 主要仪器设备Synergy2型自动酶标仪，美国BioTek公司；DHG-9053A型电热鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；DNP-9002BS型电热恒温培养箱，上海新苗医疗器械制造有限公司；LDZM-40KCS型高压蒸汽灭菌器，上海神安医疗器械厂；VS-1300L-U型超净工作台，苏净安泰集团；H-2050R型高速冷冻离心机，湖南湘仪实验室仪器开放有限公司；Tescan Mira3型扫描电子显微镜，日本捷克Tescan公司。
1.4 实验方法 1.4.1 菌悬液制备将贮藏于-80 ℃的菌种接种于TSB中，活化2~3代后，吸取少量菌液进行平板涂布，培养后重复平板划线。挑取活化好的菌种37 ℃培养8 h，菌悬液用无菌生理盐水稀释至106~107 CFU/mL，保存备用。
1.4.2 最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)采用二倍梯度稀释法[9]测定ε-PLH对腐败希瓦氏菌的MIC。通过使用96孔板进行ε-PLH溶液的二倍梯度稀释，获得最终浓度为2.0、1.0、0.5、0.25 mg/mL的溶液。各孔分别接种100 μL的菌悬液，混匀后于37 ℃振荡培养24 h，最后用酶标仪测定OD600，以肉眼观察，未变浑浊的最低浓度为ε-PLH对腐败希瓦氏菌的MIC。将MIC和高于MIC浓度的菌悬液于TSA培养基中进行平板涂布，37 ℃培养24 h后，以无菌生长的ε-PLH最低浓度为MBC。
1.4.3 微生物生长曲线将菌悬液按1%的接种量分别加入1/2MIC、MIC和2MIC的ε-PLH溶液中，以不添加ε-PLH的菌液作为对照组(CK)，37 ℃振荡培养24 h，用全自动微生物生长曲线分析仪测定OD600，每隔2 h测定一次。
1.4.4 电导率参考DIAO等[10]研究方法，稍作修改。将菌悬液按1%的接种量分别加入1/2MIC、MIC和2MIC的ε-PLH溶液中，于摇床37 ℃培养。分别于离心0、3、6、9、12 h时取上清液稀释20倍测定其电导率。
1.4.5 碘化丙啶(PI)摄入量参考蓝蔚青等[1]研究方法测定。在1/2MIC、MIC和2MIC的ε-PLH溶液中接种菌悬液后，加入1.0 mg/mL的PI染色液。避光孵化15 min，离心后弃上清液，沉淀用PBS缓冲液洗涤2次，用荧光分光光度计测定，波长条件为激发光波长490 nm，发射光波长635 nm。
1.4.6 LDHase、AKPase与ATPase活性通过1.4.5节获得上清液，按照LDHase、AKPase与超微量总ATPase试剂盒测定各组在不同处理时间的酶活性值。
1.4.7 微观结构观察参考蓝蔚青等[11]研究方法，将菌悬液按1%的接种量分别加入1/2MIC、MIC和2MIC的ε-PLH溶液中，于摇床37 ℃培养6 h后，取2 mL菌液8 000 r/min离心5 min，收集沉淀。沉淀用2.5%戊二醛溶液悬浮后固定10 h，然后用PBS缓冲液洗涤3次后弃上清液，再用30%、50%、70%、90%和100%乙醇进行梯度脱水，冻干后固定喷金，在扫描电镜下观察菌体形态结构。
1.5 数据处理每组样品设3个平行。文中全部数据通过平均值±标准差来表示。利用SPSS 17.0对数据进行单因素方差分析，采用Duncan’s法进行显著性分析和多重比较，差异显著水平P＜0.05；用Origin 8.5软件作图。
2 结果与分析 2.1 MIC和MBC由图 1可知，与对照组相比，当ε-PLH为1.0 mg/mL时，其OD600约为0.11，说明该质量浓度对腐败希瓦氏菌的生长有明显的抑制作用。而当ε-PLH浓度降至0.5 mg/mL甚至更低时，其OD值显著升高，初步判断其MIC值为1.0 mg/mL。随后通过对平板涂布计数结果(图 1b)观察得到，质量浓度为1.0 mg/mL处理组培养皿有少量菌落；当浓度升至2.0 mg/mL时，无菌落生长，故ε-PLH对腐败希瓦氏菌的MBC为2.0 mg/mL。因此，在一定浓度范围内，ε-PLH对腐败希瓦氏菌的抑制作用与浓度呈正相关关系。
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同一小写字母表示组内无显著差异(P＞0.05)。 The same lowercase letter means no significant difference within a group (P > 0.05). 图 1 ε-PLH对腐败希瓦氏菌的最小抑菌浓度与最小杀菌浓度的影响 Fig. 1 Effect of ε-PLH on MIC and MBC of Shewanella putrefaciens |
从图 2可以看出，CK组菌体生长旺盛，2 h后进入对数生长期，直至16 h后进入稳定期。1/2MIC组菌体的生长趋势与CK组相似，其在整个生长阶段的OD600均低于CK组。而经MIC和2MIC的ε-PLH处理后，腐败希瓦氏菌生长受到明显抑制，MIC组菌体对数生长期延迟至14 h，2MIC组在生长期内无细菌生长。表明ε-PLH能显著抑制希瓦氏菌的生长，且ε-PLH浓度越高，其作用效果越明显。研究结果与蓝蔚青等[12-13]研究复合保鲜剂对金黄色葡萄球菌抑菌作用相似。
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图 2 ε-PLH对腐败希瓦氏菌生长曲线变化影响 Fig. 2 Effect of ε-PLH on the growth curve of Shewanella putrefaciens |
当抑菌剂对菌体细胞造成破坏时，内容物泄漏导致培养液的导电性增强，因此通过测定电导率可反映菌体细胞膜通透性的变化[14]。由图 3可知，各组电导率在前期呈明显的上升趋势，但各组菌体在前3 h时的电导率差异不明显，可能由于菌体细胞的结构特性在初期对ε-PLH表现出一定耐受性。3 h后，MIC组和2MIC组电导率持续升高，MIC组和2MIC组的电导率在6 h时比对照组增加了3.45%与5.58%，而CK组和1/2MIC组的电导率维持在相对平稳状态。可能由于菌体经ε-PLH处理后，菌体细胞膜的通透性发生变化，导致K+和Ca2+等电解质泄漏，电导率随之升高。ZHANG等[15]研究得出菌液的电导率随保鲜剂浓度的增加而上升，结果与本研究一致。何静如等[16]也得到类似结论。可见ε-PLH浓度越高，菌体细胞膜通透性越大，胞内的无机盐离子大量流失，破坏胞内稳态，实现其抑菌作用。
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不同小写字母代表组间差异显著(P＜0.05)，不同大写字母代表组内差异显著(P＜0.05)。 Different lowercase letters represent significant differences between groups (P < 0.05), and different uppercase letters represent significant differences within groups (P < 0.05). 图 3 ε-PLH对腐败希瓦氏菌电导率值变化影响 Fig. 3 Effect of ε-PLH on the electrical conductivity of Shewanella putrefaciens |
PI是大分子的荧光染料，当细胞膜结构被破坏，通透性发生改变，核酸泄漏至胞外，与PI结合会发出荧光[17]，故可用于判断菌体细胞膜的完整性。
从图 4可以看出，PI摄入量与ε-PLH浓度呈正相关。处理组的PI摄入量明显高于CK组。在6 h后，1/2MIC组、MIC组和2MIC组的摄入量是CK组的1.85倍、2.13倍和2.42倍，表明ε-PLH能在一定程度上破坏菌体细胞膜的完整性，ε-PLH的抗菌活性随其浓度升高而增大。可能由于ε-PLH处理浓度增加，严重损坏菌体结构，使PI荧光染料更易进入细胞。朱金帅等[18]研究发现，腐败希瓦氏菌经没食子酸处理后，其凋亡程度增加，可能由于菌体细胞膜被破坏，通透性增加，使细菌凋亡。
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不同小写字母代表组间差异显著(P＜0.05)，不同大写字母代表组内差异显著(P＜0.05)。 Different lowercase letters represent significant differences between groups (P < 0.05), and different uppercase letters represent significant differences within groups (P < 0.05). 图 4 ε-PLH对腐败希瓦氏菌PI摄入量变化影响 Fig. 4 Effect of ε-PLH on the PI intake of Shewanella putrefaciens |
另外，可发现PI摄入量与电导率变化趋势相一致。随着ε-PLH浓度的增大，其均表现出对菌体细胞膜破坏程度增加，导致细胞膜通透性增大，核酸或蛋白质等胞内物质流出，使外来物质更易进入细胞内环境。
2.5 LDHase与AKPase活性LDHase是一种将乳糖催化为丙酮酸的氧化还原酶，在生物糖酵解途径中起着重要作用[1]，若细胞膜破损，其就会从细胞质中泄露至胞外。一般情况下，存在于细胞壁与细胞膜之间的碱性磷酸酶会因细胞结构遭到破坏而流出[19]。因此，可通过检测酶活力来判断菌体结构的破坏程度。ε-PLH对菌体LDHase与AKPase活性变化影响如图 5所示。
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不同小写字母代表组间差异显著(P＜0.05)，不同大写字母代表组内差异显著(P＜0.05)。 Different lowercase letters represent significant differences between groups (P < 0.05), and different uppercase letters represent significant differences within groups (P < 0.05). 图 5 ε-PLH对腐败希瓦氏菌LDHase与AKPase活性变化影响 Fig. 5 Effect of ε-PLH on the LDHase and AKPase activity of Shewanella putrefaciens |
从图 5a可以看出，腐败希瓦氏菌经ε-PLH处理6 h后，MIC组和2MIC组中的LDHase活性分别从0 h的(1.26±0.03，与(1.36±0.02)U/g pro升至(4.72±0.09)与(5.86±0.02) U/g pro，明显高于CK组和1/2MIC组，表明菌体经ε-PLH处理后，受到一定程度损伤，使其内容物流出，达到抑菌效果。这与陈梦玲等[20]研究发现腐生葡萄球菌经过牛至精油处理6 h后，胞外LDHase活性明显升高的结果趋势一致。
AKPase是一种磷酸单酯酶，菌体生长异常时，可在胞外被检出，存在于细胞壁和细胞膜之间，因此AKPase活性可反映细菌细胞壁完整性[21]。如图 5b所示，CK组的AKPase活性值为(0.084±0.012)U/mg pro，表明菌体细胞壁未遭受破坏。经过MIC和2MIC的ε-PLH处理6 h后，其值分别达到(0.36±0.01)和(0.41±0.01)U/mg pro，且其值随着ε-PLH浓度增加而增大，表明菌体的细胞壁破坏明显，通透性增加，从而影响菌体的正常生长代谢。
相关研究发现，多阳离子抗菌物质可与带负电荷的脂多糖或磷壁酸结合，破坏细胞壁的完整性，导致细胞壁屏障功能丧失或阻断营养物质流通，同时细菌消耗营养物质，最终使菌体死亡。本研究结果与ZHANG等[22]所研究的球藻CGMCC 6882产生的多糖对大肠杆菌细胞壁的作用机制相似。
2.6 ATPase活性ATPase是广泛分布在细胞膜上的酶，其主要是通过利用ATPase水解产生能量，对Na+、K+、Ca2+、Mg2+等进行由低至高浓度的运输，维持生物体正常生长代谢[23]。
由图 6可知，CK组的ATPase活性保持稳定，而经1/2MIC、MIC和2MIC ε-PLH处理6 h后，腐败希瓦氏菌的ATPase活性分别下降22.39%、35.44%和48.24%，且下降程度与处理浓度呈正相关。通常情况下，ATPase的低水平会直接影响细胞的能量代谢和功能，导致菌体死亡[24]。可能由于ε-PLH通过菌体细胞膜进入胞内，抑制ATPase活性，导致菌体代谢紊乱，最终导致其死亡。这与周倩倩等[25]利用丁香酚探究腐败希瓦氏菌的结果相似。GUO等[26]利用代谢组学发现芳樟醇处理腐败希瓦氏菌后，菌体细胞膜损伤严重，ATPase活性显著降低，阻碍了碳水化合物的代谢。这也与李兆亭等[27]的研究结果相似，其分析ATPase的活性降低破坏了胞内蛋白的代谢，从而改变细胞膜的通透性。
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不同小写字母代表组间差异显著(P＜0.05)，不同大写字母代表组内差异显著(P＜0.05)。 Different lowercase letters represent significant differences between groups (P < 0.05), and different uppercase letters represent significant differences within groups (P < 0.05). 图 6 ε-PLH对腐败希瓦氏菌ATPase活性变化影响 Fig. 6 Effect of ε-PLH on the ATPase activity of Shewanella putrefaciens |
由此可知，ε-PLH影响了ATPase的活性，且其变化与电导率和PI摄入量呈负相关，表明ε-PLH通过破坏细胞结构，影响菌体内环境的生理代谢，最终抑制细菌生长，甚至导致菌体死亡。
2.7 SEM由图 7可知，CK组的腐败希瓦氏菌呈短杆状，菌体细胞形态完整，表面平滑。经MIC的ε-PLH处理后，菌体出现凹陷、孔洞等现象，外观已发生改变。而经2MIC ε-PLH处理后，菌体细胞壁与细胞膜受损严重，内容物渗漏，菌体严重变形。可能由于ε-PLH在细胞表面静电吸附，导致细胞膜和细胞壁剥离，内容物流出，使细胞受到生理损伤，且菌体受损程度与作用浓度呈正相关。这与徐宇辰[28]研究阿魏酸甲酯对腐败希瓦氏菌的抑菌作用结果相似。这也与ZHANG等[29]银杏叶提取物处理希瓦氏菌的结果趋势一致。
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图 7 ε-PLH对腐败希瓦氏菌微观结构变化影响(×18 000) Fig. 7 Effect of ε-PLH on the microstructure of Shewanella putrefaciens(×18 000) |
由研究结果得出，通过ε-PLH处理后的腐败希瓦氏菌，其菌体细胞膜通透性发生变化，胞内电解质泄漏。酶活性分析与SEM观察结果表明，ε-PLH可破坏腐败希瓦氏菌细胞壁和细胞膜的完整性，对细胞内环境产生一定影响，使细胞代谢紊乱，最终抑制腐败希瓦氏菌的生长代谢，导致菌体死亡。因此，ε-PLH在食品领域具有广泛的应用前景，研究结果可为ε-PLH在水产品保鲜中的应用提供理论参考。
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2. Shanghai Aquatic Products Processing and Storage Engineering Technology Research Center, Shanghai 201306, China;
3. National Experimental Teaching Demonstration Center for Food Science and Engineering, Shanghai 201306, China