水产品含有丰富的脂质、蛋白质，营养价值高，对人体的健康发挥着重要的作用^[1]，但在常温下易腐败变质。为了使水产品的品质损失降到最低，通常采用低温贮藏的手段，根据不同的贮藏温度，由高到低可分为冷藏^[2]、冰藏^[3]、微冻^[4]和冻藏^[5]4种低温贮藏方式，其中冻藏使用最广泛，对水产品品质的保护效果也最显著。但由于温度的变化及冰晶的形成与生长，水产品自身的组织结构遭到了破坏，加上相关酶的作用，品质也会随之受到影响^[6]，如脂质氧化^[7]、蛋白质变性^[8]、质构变化^[9]等，其中蛋白质的冷冻变性是水产品品质变化的重要表现之一^[10]。

蛋白质的冷冻变性指的是在低温贮藏条件下，蛋白质紧密、稳定的天然立体结构遭到破坏，导致蛋白质的理化性质、生理功能发生改变，但其一级结构仍然保持不变的现象^[11]。研究^[12]表明，蛋白质冷冻变性的影响因素有多方面，刘小莉等^[13]研究了不同冻藏温度下斑点叉尾鱼片的蛋白质理化性质的变化特点，发现随着冻藏温度的降低，蛋白质理化性质的变化趋势变得迟缓，冻藏温度的高低会影响蛋白质冷冻变性的程度。XIE等^[14]在研究中侧重分析了蛋白质在冻藏期间的变化特点，由二维红外光谱曲线拟合分析的结果得到蛋白质变性的过程大致分为3个时期：稳定期(0~4周)、缓慢变化期(4~12周)和变质期(＞12周)，得出了冻藏时间的长短会影响蛋白质冷冻变性的结论；ZHANG等^[15]探讨了蛋白质变性与冻结速率的关系，结果显示与快速冻结相比，缓慢冻结样品组的肌原纤维持水能力下降，表面疏水性增加，肌原纤维蛋白的变性更明显；提出了一个模型来解释这种现象：即在缓慢冻结中，质子集中在未冻结的水中，导致接近结构蛋白质的pH降低，蛋白质发生变性，与此同时，大冰晶在肌纤维外形成，导致肌纤维横向收缩，而在快速冻结中，小冰晶能捕获质子，使蛋白质变性和解冻损失的程度较小，结果表明冻结速率也是蛋白质冷冻变性的影响因素之一。这些文献阐述了冻藏温度、冻藏时间和冻结速率对蛋白质变性的影响，而不同的冻藏温度、时间和冻结速率对蛋白质变性的影响程度不同，这与蛋白质自身结构在不同条件下的变化以及冰晶的生长有着密切的联系。

蛋白质发生冷冻变性后，由于自身结构被破坏，其理化性质和生理功能也会发生相应的变化。目前研究中测定蛋白质变性程度的理化指标主要有蛋白质的空间结构(蛋白质二级结构的变化)、Ca²⁺-ATPase活性、巯基和二硫键含量、溶解性以及蛋白质分子表面的疏水性等^[16]。

1 冻藏过程中肌原纤维蛋白理化性质的变化 1.1 空间结构

鱼类的肌原纤维在电镜下的结构呈长筒状，总体结构以1条粗丝为中心，6条细丝包围在四周，呈六角形的形状，横切面由粗丝和细丝交叉穿错，形成有序的排列，纵切面分为暗带和明带，有明暗相见的横纹分布^[17]。研究表明，通过电子显微镜^[18]、光学显微镜^[19]和傅里叶红外光谱技术^[20]都可以观察水产品(如鱼类)肌肉的微观结构以及肌原纤维蛋白构象(如α-螺旋、β-折叠、无规则卷曲等结构)的变化。

鱼肉在冻藏过程中温度的变化和冰晶的生长会使肌原纤维蛋白结构破坏发生变性，扫描电镜的实验结果显示，肌原纤维的空间结构在变性后发生明显的变化，有大量空隙和裂缝出现，粗丝和细丝排列杂乱且松散，同时SDS-PAGE电泳图谱表现为色带变淡变浅、消失，或者生成新的条带^[17]。在蛋白质的所有二级结构中，α-螺旋是稳定性最高的有序结构，因而可将α-螺旋结构的含量作为蛋白质空间结构稳定性的判定指标。林婉玲等^[21]通过SDS-PAGE电泳和红外光谱分析对草鱼冻藏期间蛋白质的二级结构进行了研究，实验中红外光谱分析的结果显示，在冻藏期间草鱼肌原纤维蛋白的α-螺旋结构含量呈不断下降的趋势，β-折叠、β-转角、无规则卷曲结构的含量不断增加，蛋白质分子由有序逐渐转向无序。高文宏等^[22]利用拉曼光谱分析了冷冻鱼糜在冻藏过程中蛋白质结构的变化，结果也显示草鱼鱼糜的蛋白结构逐渐由规整有序变得疏散无序。这些研究分别通过不同的技术和方法测定了冻藏期间蛋白质发生变性后空间结构的变化。

1.2 溶解性

溶解性是体现蛋白质冷冻变性的重要指标，能反映出蛋白质变性和聚集的具体变化。邓思杨等^[23]在探究鲤鱼肌原纤维蛋白功能结构的变化时发现，肌原纤维蛋白的溶解性总体上呈显著下降的趋势，原因在于肌原纤维蛋白属于盐溶性蛋白，蛋白质分子能通过化学键(共价键与非共价键)的作用形成高分子聚合物，从而导致蛋白质的溶解性下降。GAO等^[24]研究了可溶性大豆多糖和液氮速冻在蛋白质变性中的协同作用，实验中所有样品组蛋白质的溶解度在前4周急剧下降，12周后蛋白质溶解度降至53.14%。CROPOTOVA等^[25]研究了在冻藏(-40 ℃)、微冻和冷藏3种不同贮藏温度下大西洋鲭鱼鱼片蛋白质溶解性和氧化程度的变化，发现肌原纤维蛋白的溶解度在低温贮藏期间显著降低，且肌原纤维蛋白的含量和相关组织蛋白酶活性呈负相关。这种现象可以通过冰晶对细胞的损伤、溶酶体释放的蛋白酶有害活性的共同作用来解释。

1.3 Ca²⁺-ATPase活性

肌球蛋白头部的Ca²⁺-ATPase对低温条件下蛋白质结构完整性的变化十分敏感，冻藏期间肌原纤维蛋白发生变性，Ca²⁺-ATPase活性会出现不同程度的降低。ZHANG等^[26]通过添加蛋白质水解物来防止蛋白质氧化，冻藏3个月时对照样品组中Ca²⁺-ATPase活性急剧损失，而添加水解物的组别表现出较低的Ca²⁺-ATPase活性损失，由于低分子量肽的存在且比例较高，水解物对肌球蛋白头部变性的预防效果较好。ZHANG等^[27]评价了温度波动下虾肌原纤维蛋白Ca²⁺-ATPase活性的变化，结果也显示随着温度波动周期的增加，所有样品组的肌原纤维蛋白含量和Ca²⁺-ATPase活性均显著降低。仪淑敏等^[28]在研究菊粉对冻藏鲢鱼的肌原纤维蛋白特性的影响时发现，各组样品在冻藏初期Ca²⁺-ATPase活性总体上均呈下降趋势，而在冻藏5周之后，添加菊粉实验组的下降速度最慢，分析原因在于菊粉作为抗冻剂会影响冰晶的形成与生长，从而减缓了蛋白质的变性程度以及Ca²⁺-ATPase活性的下降趋势。

1.4 巯基、二硫键含量

肌动蛋白头部结构的改变会使内部的巯基暴露出来，进而氧化成二硫键，因此巯基和二硫键的含量可以作为衡量蛋白质变性程度的重要指标^[29]。李学鹏等^[30]研究发现在-18 ℃和-80 ℃两种贮藏温度下，大黄鱼的总巯基含量在前3个月均出现明显减少的趋势，且-18 ℃冻藏温度组总巯基含量略低于-80 ℃冻藏温度组。马文慧等^[31]在探讨冷冻贮藏过程中乌鳢鱼片的品质变化时发现，-18 ℃和-40 ℃两组不同贮藏温度的样品组巯基含量均逐渐降低，并且较低温度的冻藏条件可以更有效地抑制巯基的氧化、二硫键的生成。ZHANG等^[32]在分析鲢鱼鳍水解物对鳙鱼片蛋白质和脂肪氧化的作用时发现，对照组中的巯基含量的下降较为显著，而添加茶多酚和水解产物能有效地延缓巯基含量的下降。这些文献都指出了蛋白质变性时巯基氧化成二硫键的现象，并提到温度等一些因素可以降低蛋白质的变性程度。

1.5 表面疏水性

蛋白质分子的表面疏水性是指存在于蛋白质分子表面的疏水性氨基酸的相对含量。姚慧等^[33]研究了卡拉胶对秘鲁鱿鱼的肌原纤维蛋白生理功能和特性的影响，各组样品的肌原纤维蛋白表面疏水性均显著上升。ZHANG等^[34]在探讨臭氧处理对鲢肌原纤维蛋白的影响时发现，实验中各组样品的蛋白质表面疏水性在冻藏7 d内均显著增加。袁丽等^[35]通过拉曼光谱对凡纳滨对虾蛋白质的变化进行了研究，随着冻藏时间的延长，蛋白质的表面疏水性总体上呈增加的趋势。其他研究也显示大黄鱼^[36]、真鲷^[16]等的肌原纤维蛋白表面疏水性也呈现相似的变化趋势。

综上所述，冻藏过程中水产品的肌原纤维蛋白会发生不同程度的变性，导致蛋白质的理化性质和功能特性产生相应的变化，如空间结构的无序化，二级结构中α-螺旋含量的降低及β-折叠、无规卷曲等含量的增加，溶解性下降，Ca²⁺-ATPase活性下降，巯基的含量减少、二硫键的含量上升，表面疏水性增加等，由此给水产品品质带来不利影响。

2 冻藏过程中蛋白质变性的机理

蛋白质的冷冻变性普遍存在于水产品的低温贮藏中，目前已研究并被广泛接受的蛋白质冷冻变性的机理主要包括结合水脱离变性、水和结合水相互作用、溶质浓缩变性等3种学说^[37]，这些都与蛋白质的脱水和冰晶的形成有密切关系。

在冻藏初期，自由水先冻结成冰晶，结合水继续与蛋白结合，随着冻结的深入和温度的降低，尚未结冰的水也慢慢冻结成冰晶，与蛋白发生脱离，蛋白质内部的二硫键、疏水键等开始聚集，侧链慢慢靠拢，发生不可逆变性，这种现象称为结合水脱离变性，机理见图 1^[8]。冰晶的生长会改变蛋白质分子与水分子之间的状态，使蛋白质内部的化学键断裂，空间结构发生变化，引起变性^[38]；水分子在冻结过程中不断形成冰晶并析出，造成细胞液浓缩，溶质浓度上升，导致细胞的离子浓度和pH发生改变，引起蛋白质发生冷冻变性^[39](图 2)，这是由溶质的浓缩变性而造成的蛋白质冷冻变性。

对蛋白质冷冻变性的机理研究，除上述3种学说外，冰晶的生长、蛋白质的氧化、脂质的氧化以及组织中酶的作用都会在一定程度上诱导蛋白质发生变性，这也成为目前研究的热点之一。

3 控制蛋白质冷冻变性的措施

蛋白质的冷冻变性在低温贮藏过程中无法避免，如何控制和减缓蛋白质的变性、延缓水产品品质的损失速度成为目前研究的主要方向。添加抗冻剂是迄今为止保护效果最显著的一种方法^[40]，能够降低水产品肌原纤维蛋白的变性程度，延缓水产品品质的损失。目前研究最广泛的几类抗冻剂主要包括糖类抗冻剂、酚类抗冻剂和以磷酸盐为主的盐类抗冻剂，此外一些蛋白水解物、多肽和氨基酸等近年来也被关注和研究^[41]。

3.1 糖类抗冻剂

糖类作为抗冻剂在水产品低温贮藏中的应用已十分广泛，主要包括海藻糖、壳聚糖、低聚木糖、麦芽糖、蔗糖等，糖类含有大量的游离羟基，可以结合水分子，阻止冰晶的形成与生长，从而抑制蛋白质的变性。苏赵等^[42]探讨了不同含量海藻糖对鱼糜的蛋白质变性和凝胶形成能力的影响，扫描电镜发现海藻糖添加量为6%的样品组蛋白质凝胶的三维网络结构更牢固、更致密，表明质量分数6%的海藻糖对草鱼鱼糜的蛋白质变性有抑制作用，其次可以束缚水分子，减少冰晶的形成，达到延缓鱼糜品质下降的效果。陈金玉等^[43]研究了海藻糖和甘露醇的协同抗冻作用，结果显示能有效地抑制蛋白变性，降低了蛋白结构的变化程度，改善了凝胶性能、三维网络结构和乳状液稳定性等，另外，通过与水分子的结合，海藻糖和甘露醇也同样减少了冰晶的形成，延缓蛋白质聚集和变性，提高了冻藏过程中水产品的品质。LIU等^[44]在探究魔芋葡甘聚糖对红鲷鱼糜理化性质的影响时发现，添加常规低温保护剂和魔芋葡甘聚糖都可以抑制蛋白质变性，改善蛋白质凝胶强度。ZHANG等^[45]研究了低聚木糖对白虾的冷冻保护作用，与对照样品相比，低聚木糖处理的虾的质构(弹性和咀嚼性)保持较好，且具有较高的肌原纤维蛋白含量，染色结果也表明低聚木糖的处理显著减缓了对肌肉组织结构的损伤。这些文章探究了海藻糖、魔芋葡甘聚糖和低聚木糖等糖类在抑制蛋白质变性方面的作用，为以后其他糖类的研究提供了方向和基础，也体现了糖类作为抗冻剂的广阔前景。

3.2 酚类抗冻剂

酚类可以抑制微生物的生长繁殖，延缓蛋白质的变性及降解，目前作为抗冻剂使用较多的酚类主要有茶多酚、α-生育酚、苹果多酚等，大部分使用到的酚类可从植物提取物中获得，天然无害，因而也成为目前研究的热点之一。TANG等^[46]研究探讨了α-生育酚对鲟鱼鱼糜理化性质的影响，从总活菌数、pH来看，α-生育酚对冷冻鱼糜的保护作用优于常规抗冻剂，从可溶性蛋白质含量、总巯基含量和表面疏水性来看，α-生育酚与常规抗冻剂的保护效果无差异，这表明α-生育酚在保持鱼糜冻藏品质方面是一种很有前途的替代抗冻剂。SUN等^[47]在探讨4 ℃贮藏期间苹果多酚对草鱼鱼糜品质的影响时发现，苹果多酚在体外具有很强的抗氧化性，抑制了肌原纤维蛋白的降解，延长了草鱼鱼糜的感官保质期，在冷藏期间对草鱼鱼糜的品质具有很好的保护作用，且在蛋白质其他功能特性方面苹果多酚也发挥了显著的作用，在抗冻保护剂的研究领域具有广阔的前景。茶多酚是一种良好的抗氧化剂和保鲜剂，目前已被广泛使用在各类食品的保藏保鲜中。林静^[48]研究发现茶多酚对微冻过程中泥鳅品质的保护有明显的改善作用，经过茶多酚处理的样品色差值、感官指标、质构指标、汁液损失的下降受到了显著的抑制，菌落总数、TVB-N值、TBA值的上升趋势明显延缓。研究表明茶多酚、α-生育酚、苹果多酚等酚类物质是很好的冷冻保护剂，能在一定程度上抑制蛋白质发生变性，在水产品的品质保护方面提供了更多的选择。

3.3 盐类抗冻剂

由于成本较低、使用方便，盐类抗冻剂的应用较为广泛，尤其是磷酸盐，适量的磷酸盐能够提高鱼肉的pH和蛋白凝胶的保水性，减少品质损失。张文婷等^[49]研究了-18 ℃下添加三聚磷酸盐鱼糜蛋白质的抗冻情况，冻藏8周后，添加三聚磷酸盐的实验组指标都优于未处理的对照组，表明在鱼糜中加入三聚磷酸盐能在一定程度上防止蛋白质变性，提高鱼糜的抗冻性。SVEINSDÓTTIR等^[50]也在实验中探讨了聚磷酸盐混合物对冻藏期间大西洋鲭鱼片理化稳定性的作用，结果表明其延长了鱼片的货架期，减少了水产品的品质损失。为了有效地控制蛋白质变性，研究中通常采用磷酸盐与其他类型抗冻剂复配的方法，在使用时还应注意控制磷酸盐的用量，因添加过多磷酸盐会影响人体对钙的吸收。

3.4 其他方法

除了上述3种类型抗冻剂外，蛋白质和多肽、氨基酸、水产品降解物等也在控制蛋白质变性方面发挥着重要的作用。LIN等^[51]在评价鳙鱼鳃水解蛋白对鱼糜蛋白质氧化的抑制作用时发现，与未处理的鱼糜相比，经水解物处理的鱼糜具有较高的巯基、盐溶蛋白含量和Ca²⁺-ATPase活性，较低的二硫键、羰基含量和疏水性，以及较好的凝胶强度和质地，该水解物对鱼糜具有与蔗糖相近的抗氧化作用和冷冻保护作用。TAO等^[52]研究了γ-聚谷氨酸在-20 ℃冻藏温度下对草鱼鱼糜的冷冻保护作用，结果表明γ-聚谷氨酸保持了冷冻草鱼鱼糜的品质性状、凝胶结构和感官评分，不同浓度的γ-聚谷氨酸中，0.8%的γ-聚谷氨酸对草鱼鱼糜的冷冻保护效果最好，其保护效果也优于常规冷冻保护剂。

抗冻剂是目前使用最多、效果最显著的一种方法，以上综述了部分糖类抗冻剂、酚类抗冻剂、盐类抗冻剂和其他类别抗冻剂的应用，此外有研究表明其他处理技术对控制蛋白质冷冻变性也发挥了显著的作用。储渊明等^[53]讨论了镀冰衣技术在水产品贮藏中的应用，在水产品表面镀上不同功能性的冰衣，如防龟裂型冰衣、抗氧化型冰衣、抑菌型冰衣等，能够有效地减少冻藏过程中发生的不良变化，对冰晶的生长、脂质氧化、蛋白质变性都起到了一定的抑制作用。LI等^[54]研究了含ε-聚赖氨酸的壳聚糖-海藻酸钠生物活性涂层结合气调包装技术对肌原纤维蛋白的影响，结果表明这种处理方法抑制了羰基的形成，保持了较高的巯基含量和较好的Ca²⁺-ATPase活性，蛋白质构象变化较小，肌原纤维蛋白的变性得到显著延缓。镀冰衣技术、涂层与气调包装的联用使蛋白质变性的控制措施不局限于抗冻剂的使用，为以后的研究提供了新的方向。

4 总结与研究展望

水产品营养价值丰富，如何对水产品进行合理的贮藏，实现对其品质保护的最大化是目前研究的热点。相比于其他保藏手段，冷冻贮藏能对水产品的品质做到较好的保护，成为目前最常使用的一种保藏方法。但温度和冰晶的影响导致的蛋白质变性和其他生理变化仍然会对水产品的品质造成一定的损失，水产品资源高效利用也随之受到影响。目前研究中不乏对蛋白质冷冻变性机理的探讨，但都集中在生化反应的表观现象与变化，没有对其详细的作用机制做出解释，冷冻变性过程中蛋白质分子发生的动态变化和变化规律也都有待后续研究的深入。了解蛋白质冷冻变性的各种影响机理和变化规律，才能为控制蛋白质冷冻变性的发生提供更多的新方法。抗冻保护剂仍然是低温条件下控制蛋白质发生变性的最有效的方法，目前研究中使用的各类抗冻剂虽能对蛋白质的冷冻变性起到一定的控制效果，但都存在着制作成本较高、难以获得、潜在危害、附加反应等缺点，因此开发新型、健康、天然、易得的抗冻剂成为当前研究的重点和热点所在。未来还可探究不同冷冻技术与各类抗冻剂的联用来获得控制蛋白质冷冻变性的最佳方法，如超声波辅助技术、高压静电场等。