太平洋褶柔鱼(Todarodes pacificus)又名东洋鱿、日本鱿等，属头足纲(Cephalopoda)枪形目(Teuthida)柔鱼科(Ommastrephidae)褶柔鱼亚科(Todarodinae)褶柔鱼属(Todarodes)^[1]，主要分布在太平洋21°N~50°N海域，分为冬生群、秋生群和夏生群，为一年生暖温性长距离洄游种类^[2-3]。太平洋褶柔鱼是世界上最早被大规模开发利用的头足类种类之一，20世纪70年代后期由于过度捕捞其产量急剧下降，随后产量慢慢回升，但1997—1998年经历了强厄尔尼诺后，其产量锐减至历史最高产量的一半^[4]。作为一种高度洄游生物，其生长、繁殖受环境影响较大^[5]，进而影响该种群资源丰度，需引起广泛重视，合理开发利用并加强管理太平洋褶柔鱼资源亟待需要。

线粒体是真核细胞内为细胞活动提供能量的重要细胞器，为共价闭合的环状超螺旋结构，作为细胞内核外唯一存在的遗传物质^[6-7]，包括线粒体细胞色素C氧化酶Ⅰ基因(COⅠ)、ND2、线粒体r DNA等众多基因，与核DNA相比，具有分子量小、结构简单且保守紧凑、进化速率快并遵循母系遗传、无组织特异性等特点，是一个相对独立的复制单位^[8-9]。刘连为等^[10]利用COⅠ和Cytb基因分析了北太平洋柔鱼遗传结构，因此Mt DNA标记法广泛应用于头足类种群遗传结构研究中，近些年来也逐渐应用到柔鱼类的研究中，成为研究太平洋褶柔鱼种群遗传结构的不可替代的技术手段^[11]。

目前对太平洋褶柔鱼研究主要集中于资源丰度及其评估，基础生物学和渔场时空分布等方面^{[4-5, 11-13]}。KATUGIN^[14]采用蛋白质电泳方法对太平洋褶柔鱼进行了遗传多样性分析，发现太平洋褶柔鱼存在2个亚种，并且依据其繁殖习性分为3或4个种下群体，为该种群遗传分析提供了重要的基础数据；WAKABAYASHI等^[15]利用COⅠ和16S rRNA重新推断了柔鱼科的系统发育关系，认为褶柔鱼亚科中，太平洋褶柔鱼与双柔鱼(Nototodarus)的种类关系比南极褶柔鱼(Todarodes filippovae)的关系更为密切。太平洋褶柔鱼经历被开发利用、过度捕捞再到产量逐渐回升以及环境不断变化等，该种群遗传结构是否已经产生变异, 发生变异的主要原因是什么，目前相关研究较少。因此，为进一步规范和提升太平洋褶柔鱼的渔业资源管理，该研究利用COⅠ和Cytb分子标记法综合分析了太平洋褶柔鱼的遗传结构和变异，以期为太平洋褶柔鱼渔业资源的开发和管理提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 材料来源

样本由中国鱿钓船于2018年12月—2019年1月在日本海、东海和西北太平洋生产调查期间采集，采样点、采样时间及样本数量见表 1。

1.2 实验方法 1.2.1 太平洋褶柔鱼基因组提取及PCR链式扩增

取太平洋褶柔鱼肌肉50 mg左右，利用酚-氯仿法提取基因组DNA^[16]，用NanoDrop 2 000 C超微量分光光度计测量DNA浓度后于-20 ℃冰箱保存备用。该研究获得的COⅠ(GenBank: KY771096.1)和Cytb(GenBank: EF423147.1)序列于NCBI下载，然后用Primer 5.0软件分别设计其引物，由生工生物工程(上海)有限公司合成，具体引物序列如表 2所示。PCR反应体系总体积为25 μL，其中：引物各0.5μL，2xEasy TaqpcrSuperMix酶12.5 μL，模板DNA 1 μL，加灭菌超纯水至25 μL。PCR反应在S 1 000型双48孔PCR仪上进行。COⅠ和Cytb基因的扩增程序一致，其扩增反应条件为95 ℃预变性3 min，然后进行34个循环，每个循环包括95 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，最后72 ℃终延伸10 min。PCR扩增结束之后跑胶，若条带单一且明亮，随即送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，并分析测序结果。

1.2.2 实验数据与分析

测序完成后，首先利用MEGA 7.0软件进行序列比对^[17]，将各条不同的碱基序列首尾适当删除得到可用的序列长度，并利用邻接法(NJ)^[18]构建分子进化树；通过DnaSP 6.12软件分析^[19]单倍型数、单倍型多样性指数(h)、核苷酸多样性指数(π)以及核苷酸错配分布曲线。然后通过软件Arequin 3.1^[20]计算遗传分化系数(F_st)并进行分子生物学方差分析(AMOVA)以及Tajima’s D和Fu’s Fs中性检验。最后利用软件Network 4.0^[21]构建太平洋褶柔鱼COⅠ和Cytb单倍型网络图。

2 结果 2.1 太平洋褶柔鱼种群遗传多样性

该研究得到太平洋褶柔鱼COⅠ基因序列长度为465 bp，3个地理群体90尾样本共检测到17个可变异位点，共定义了18个单倍型(表 3)，有且仅有一个核心单倍型H_1(图 1)为其他群体所共有。3个站点太平洋褶柔鱼COⅠ序列遗传多样性指数并无显著差异(表 3)，与总体处于同一水平。样本总体表现出较低的单倍型多样性(0.493 0±0.066 0)和较低的核苷酸多样性(0.001 3±0.000 2)。

该种群Cytb基因序列长度为404 bp，3个地理群体90尾样本共检测到20个可变异位点，其中20个为多态性信息位点，共定义了21个单倍型(表 3)，唯一核心单倍型为H_2(图 1)。与COⅠ基因所表现的结果相同，3个站点太平洋褶柔鱼拥有较低的单倍型多样性(0.479 0±0.067 0)和核苷酸多样性(0.001 4±0.000 2)。

2.2 种群遗传结构变异分析

太平洋褶柔鱼COⅠ序列的分子方差分析(AMOVA)表明几乎全部的遗传变异来自于该种群内部(表 4)，遗传分化系数均为负值，基因流Nm为无穷大inf(表 5)，表明各个群体间基因交流非常频繁群体间保持着较高的遗传同质性。该种群Cytb序列AMOVA分析也表明了变异几乎来源于该群体内部，只有极少数(0.43%)变异来自群体间(表 4)。群体间遗传分化系数(F_st)绝对值接近于0，差异不显著(P＞0.95)，同时群体间基因流数值较大(表 6)，与COⅠ序列结果类似。

2.3 种群历史动态分析

该研究中太平洋褶柔鱼单倍型核苷酸错配分布分析(图 2)中都出现了明显的单峰，说明该群体可能经历过种群扩张事件，而Tajima’s D和Fu’s Fs的中性检验值(表 7)均为负值且统计检验极显著(P＜0.01)，进一步佐证该群体很可能发生过历史扩张事件。Cytb基因序列常被用来估算种群扩张时间，通过Arlequin 3.1软件计算得到基于Cytb基因序列的太平洋褶柔鱼群体的Tau为0.567，Cytb基因的进化速率为(2.15%~2.60%)/百万年^[22]，根据公式T=t×Tau/4kμ(其中k为文中分析基因序列的碱基数，μ为分析基因序列每一代的进化速率)，进一步推算群体扩张时间，得到太平洋褶柔鱼群体扩张大概发生在1.2万~1.5万年前。

3 讨论

遗传多样性是生物多样性的重要组成部分，研究太平洋褶柔鱼遗传多样性不仅能够判断该物种对环境的适应能力并揭示其起源与进化历史，而且能为遗传资源的保存提供重要的理论支持^[22]。该研究中太平洋褶柔鱼G+C含量明显低于A+T含量，具有明显AT碱基偏好性，在北太平洋柔鱼(Ommastrephes bartramii)^[10]以及中国沿海长蛸(Octopus variabilis)^[23]等大洋性头足类也有类似的结论，该特性使头足类动物具有更易变异的潜力；且太平洋褶柔鱼生命周期短、性成熟快、繁殖群体时空范围广和多季度等^[24]，这些生活史特征可能使该种群能够快速增长，保存新突变，产生高的单倍型指数h，然而该研究中太平洋褶柔鱼的h并不高。与同样基于COⅠ和Cytb序列标记的大洋性头足类相比，如北太平洋柔鱼(h_COⅠ = 0.773±0.105、h_Cytb= 0.868±0.095)、阿根廷滑柔鱼(Illex argentinus，h_COⅠ=0.535±0.066、h_Cytb= 0.528±0.058)、茎柔鱼(Dosidicus gigas，h_COⅠ= 0.743±0.055、h_Cytb= 0.767±0.047)都具有较高的单倍型多样性指数h^[10]。目前已有研究^[25]证实过度捕捞会导致海洋鱼类遗传多样性衰退，而太平洋褶柔鱼在19世纪七八十年代曾遭受过度开发^[4]，使得该种群资源量急剧减少，这有可能是导致太平洋褶柔鱼单倍型多样性不高，遗传多样性总体上偏低的原因。另外也存在太平洋褶柔鱼本身遗传多样性就低的可能，但由于缺乏历史研究数据而无从考证。因此，该研究可作为一个基线资料，供后续种质检测提供参考依据。

AMOVA分析结果表明这3个地理群体之间并未出现明显的遗传分化，从COⅠ和Cytb基因单倍型网络图中也可从侧面反映该种群有且仅有一个核心单倍型，其他单倍型之间几乎无交集。由此推断这3个站点群体可能属于同一种群。此外，东海和日本海在地理环境上不存在明显的阻隔，且亲潮-黑潮分支的入侵以及季风作用下环流的存在^[4]使得西北太平洋全年受洋流影响较大，洋流运输作用明显，同时太平洋褶柔鱼可在不同季节分批产卵，且产卵时间长、产卵量大^[24]，大量的褶柔鱼卵和幼体则可能随洋流扩散到太平洋各个区域，使得东海和日本海这3个采样群体间的基因交流十分频繁，从而与极大的基因流(Nm)结果相呼应。

另外，太平洋褶柔鱼种群扩张时间大约发生在1.2万~1.5万年前，这个时期正处于晚更新世末期。GORBARENKO等^[26]利用日本海中部和南部5个高分辨率岩芯的浮游有孔虫δ¹⁸O记录、岩性变化，发现15 kaBP前后，水体盐度逐渐恢复正常，海平面逐渐上升，大洋水进入日本海，此后，浮游有孔虫δ¹⁸O值分别在14.5 kaBP和12 kaBP前后发生2次快速变轻，水温迅速升高，太平洋褶柔鱼的卵和幼鱼可能借助海平面上升而扩散，并且该种群结构、性腺发育、分布等受环境变化，特别是水温变化的影响较大^[11]，这能够给太平洋褶柔鱼在内的其他生物的生长、繁殖及扩张提供非常有利的条件。

种群是渔业资源利用和保护的基本单位，该研究利用COⅠ和Cytb两种线粒体基因标记方法，探究了西北太平洋褶柔鱼群体遗传结构及变异分析，结果表明太平褶柔鱼遗传多样性较低且不存在显著分化，为该种群遗传分析提供了重要的基础数据。因此，可以考虑将太平洋褶柔鱼划分为一个管理单元，以便该渔业资源更加合理的保护与开发利用。