2021,
Vol. 30
表 1(Tab.1)
斑马鱼nos2a基因的生长调控作用
引用本文
高磊,
黄亚娟,
PENGLEERachit,
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鲍宝龙. 斑马鱼nos2a基因的生长调控作用[J]. 上海海洋大学学报, 2021, 30(4): 573-580.
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斑马鱼nos2a基因的生长调控作用
1.
上海海洋大学 水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室, 上海 201306;
2. 上海海洋大学 水产科学国家级实验教学示范中心, 上海 201306
2. 上海海洋大学 水产科学国家级实验教学示范中心, 上海 201306
摘要：为了在斑马鱼中探索诱导型一氧化氮合酶(Nos2)在生长调控中的作用，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，首次构建了可稳定遗传的nos2a缺失型(nos2a-/-)斑马鱼家系。通过监测其生长过程发现，nos2a-/-斑马鱼的整体生长趋势较nos2a正常型(nos2a+/+)斑马鱼偏低，且nos2a-/-成鱼的体型显著小于同期的nos2a+/+斑马鱼(P < 0.01)：nos2a+/+成鱼体长(29.53±0.60) mm，nos2a-/-成鱼体长(26.34±0.69) mm；nos2a+/+成鱼体质量(512.80±30.75) mg，nos2a-/-成鱼体质量(394.40±16.91) mg；而在肌纤维密度(P=0.718)及躯椎骨的横截面积上(P=0.548)两者没有显著差异。qPCR检测发现，出膜8 d时，nos2a-/-斑马鱼的生长激素基因gh1的mRNA水平(P < 0.01)及类胰岛素生长因子基因igf1的mRNA水平(P < 0.001)均显著低于nos2a+/+斑马鱼；出膜68 d时，nos2a-/-斑马鱼的gh1(P < 0.000 1)和igf1(P < 0.000 1)的mRNA水平同样显著低于nos2a+/+斑马鱼。以上结果表明，斑马鱼中nos2a的功能缺失导致鱼体生长受到抑制，而gh1及igf1 mRNA的水平下调是其潜在原因。
关键词：一氧化氮合酶 斑马鱼 基因敲除 生长激素 生长
一氧化氮(NO)是一种特殊的生物信号分子，广泛参与机体的生理调节，其中就包括对生长激素水平的调控[1-3]。机体的NO主要由一氧化氮合酶催化精氨酸产生。一氧化氮合酶是一种同工酶，具有3种亚型，分别为神经型(Nos1)、诱导型(Nos2)和内皮型(Nos3)[4]，但斑马鱼中仅发现神经型及诱导型[5-6]。
Nos1主要存在于神经细胞，通过调节NO的水平参与神经系统的调节[7]，也发现Nos1参与机体的肌肉和骨骼发育的调节[8-12]。Nos2主要存在于巨噬细胞，并可以通过诱导表达促进合成大量的NO，进而参与机体的免疫调节[13-15]。研究发现，Nos2 在大脑多个区域的神经胶质细胞中都有表达[16]，并且除了诱导性表达以外，也可以组成性地表达于机体的多数组织[17-18]。那么，同样存在于神经细胞并可以调节NO水平的Nos2是否也参与机体的生长发育调节呢？哺乳动物中的研究报道[19]指出在关节炎患者体内Nos2参与调控垂体生长激素的mRNA水平，而且Nos2敲除型小鼠的破骨细胞存在骨吸收功能缺陷[20]。可见Nos2与哺乳动物机体的生长发育存在一定联系，那么鱼类的生长发育调节中是否也有Nos2的参与呢？
本研究通过对模式生物斑马鱼(Danio rerio)进行nos2a基因敲除，首次构建了可稳定遗传的nos2a功能缺陷型(nos2a-/-)斑马鱼家系，并通过监测nos2a-/-斑马鱼的生长情况及生长相关激素水平的变化，对nos2a在斑马鱼生长发育中的作用进行探索。
1 材料与方法 1.1 斑马鱼饲养本研究所用的斑马鱼为AB野生型斑马鱼[21]，斑马鱼饲养于28 ℃恒温的循环水养殖系统内，每天早晚各饲喂1次，成年个体每周交配1次。受精卵及仔鱼于28.5 ℃恒温培养箱中进行孵育或饲养。
1.2 nos2a基因缺失型斑马鱼家系构建从加利福尼亚大学圣克鲁兹分校(UCSC)斑马鱼数据库中筛选出斑马鱼nos2a基因(NM_001104937)的敲除靶点(表 1)，该靶点位于其第4号外显子上。以"T7启动子序列+靶点序列+支架蛋白序列"的结构设计引物(表 1)，对连接靶向序列与Cas9蛋白的支架蛋白序列进行PCR扩增，再经转录获得靶向RNA(gRNA), Cas9 mRNA的制备则经pT3ts-nCas9n质粒线性化后转录获得，以上具体操作参考VASHNEY等[22]的步骤。
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表 1 本研究用的DNA合成序列 Tab.1 DNA sequences used in the research |
敲除中，将2种RNA(gRNA 100 pg, cas9 mRNA 500 pg)的混合液显微注射入1细胞期的野生斑马鱼受精卵中, 每颗受精卵的注射量为1.4 nL，注射后胚胎成活率约40%。经碱裂解法[23]提取受精卵或尾鳍DNA进行目的片段PCR扩增(引物见表 1)，产物通过分子测序和短小串联重复序列(STR)检测[24-25]，以检查nos2a序列的突变情况。成活的注射个体中，nos2a的有义突变率约28%。筛选1对发生相同有义突变的个体与野生型个体进行交配，获得杂合突变个体(nos2a+/-)，再从杂合突变个体的交配后代中筛选出3对初代nos2a的纯合突变体和3对未突变体。通过初代纯合个体的繁育，分别构建可稳定遗传的nos2a纯合突变家系(nos2a-/-)以及具有相同遗传背景的对照组家系(nos2a+/+)。
1.3 斑马鱼生长检测设置nos2a-/-斑马鱼和nos2a+/+斑马鱼各3个平行组(20尾/组)于统一环境中进行饲养。仔鱼用缸标准为柱形玻璃缸(内径10 cm，高5 cm，水位高3 cm)，待生长至25 dph(days post hatching)时将其转至大缸(长×宽×高=27 cm×17 cm×15 cm，水位高7 cm)饲养。每天早上8：00和傍晚6：00分别投喂1次，每次投喂保证各缸饵料供给等量且充足，进食30 min后统一吸去残饵。每天换水1次。
分别在5、10、25、40、55、85和125 dph检测各组斑马鱼个体的体长。仔鱼由于尾部发育不全，在体视镜下测量其全长；20 dph后，测量个体的标准体长(自吻端至椎骨末端的直线长度)。待可以分辨雌雄时(70 dph)，对雌雄个体加以区分，以排除性别差异对结果的干扰。
体质量检测时间点分别设置在30、50、85、110和125 dph进行，且统一在进食2 h之后开展。每次称量前，将加有适量水的容器在电子秤(精度0.001 g)上调零，再将斑马鱼用网兜兜起，甩水3次除去水分后迅速进行称量。前期鱼体较小，为减小误差多尾一起称量，再计算均值。大于70 dph的各组样本的检测统计，按雌雄分开进行，以排除性别影响。
1.4 肌肉及躯椎骨发育检测肌肉检测中，各组随机选取3尾80 dph的斑马鱼，经梯度脱水及包埋后，沿斑马鱼背腹轴在其背鳍基部末端处，经冷冻切片机(Leica CM1860，德国)对鱼体进行横切，切片经H.E染色后镜检并对肌肉纤维密度进行检测。在20倍放大倍数下，对样本的相同位置进行拍照，然后在照片中以长边1/5为边长的正方形为界随机框选5处，对框选范围内的肌纤维数量进行统计。
躯椎骨检测中，各组随机选取5尾80 dph的斑马鱼，经茜素红进行骨骼染色后进行镜检[26]，之后沿斑马鱼背腹轴在其背鳍末端处对鱼体进行横切，再镜检拍照并测量统计躯椎骨横切圆面的横、纵向径长及横剖面积，横剖面积的测量通过Photoshop软件先进行像素统计，再进行比例转换。
1.5 cDNA制备及qPCR每组取8 dph及68 dph的斑马鱼不少于5尾，参照TRIzol试剂(Ambion, 美国)说明书中提供的方法提取组织RNA(8 dph样本取全组织，68 dph样本经MS-222试剂处理后取其脑组织)。用DNA酶去除基因组DNA后，将所得RNA利用M-MLV反转录酶试剂盒(Promega, 美国)进行处理合成样本的cDNA：以总RNA为模板，oligo(dT)为引物于72 ℃反应5 min，冰浴5 min，再于42 ℃反应1.5 h。
对生长激素(gh1)及类胰岛素生长因子(lgf1)基因的mRNA水平进行定量分析，内参基因为β-actin。结合美国国家生物信息中心(NCBI)数据库提供的核酸序列，使用Primer premier 6软件设计qPCR引物(表 1)。qPCR反应按照HieffTM qPCR SYBR® Green Master Mix(翊圣生物科技有限公司，上海)说明进行，反应步骤：95 ℃，5 min；40×(95 ℃，10 s；54 ℃，30 s)。
1.6 数据分析体长、体质量及肌肉纤维等相关数据以"平均值±标准差(Mean±SD)"在柱形图上显示；椎骨相关数据以"最大值、最小值、中位数及上下四分位数"在小提琴图中显示。相关数据的比较分析及制图通过Graph Pad软件完成：数据正态性通过Shapiro-Wilk检验；nos2a+/+和nos2a-/-斑马鱼间的比较通过双尾独立t检验(方差不齐的经Welch校正)或曼-惠特尼(Mann-Whitney)独立检验进行。P＜0.05, 差异显著；P＜0.01, 差异极显著。
2 结果 2.1 nos2a基因敲除效果通过敲除后的筛选及传代，构建nos2a-/-斑马鱼的稳定遗传家系：通过对nos2a基因进行测序发现，CRISPR/Cas9编辑导致nos2a的序列发生有义突变，造成5个碱基的缺失；荧光毛细管电泳检测呈单峰，说明该突变为纯合突变，并且nos2a序列碱基的缺失，导致氨基酸编码提前终止于第4号外显子，而主要功能结构域的缺失造成蛋白功能丧失(图 1)。
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图 1 CRISPR/Cas9引发的nos2a基因突变 Fig. 1 Mutation of nos2a generated by CRISPR/Cas9 |
经过持续的体长、体质量监测(图 2)，发现nos2a-/-斑马鱼体型整体的增长趋势较野生型偏低，这种差异在出膜后2个月左右开始凸显，且在雌雄个体中均有发生；此外，至监测结束(125 dph)，nos2a-/-斑马鱼的体长比nos2a+/+斑马鱼的短(P=0.006)，体质量也比nos2a+/+斑马鱼的小(P=0.002)。
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*.P＜0.05；**.P＜0.01. 图 2 生长过程中体长、体质量监测 Fig. 2 Body length and mass measurement |
为了分析nos2a-/-及nos2a+/+斑马鱼在肌纤维发育上的差异，对两组斑马鱼躯干背腹轴横切面上单位面积内的肌纤维数量的统计发现，nos2a-/-斑马鱼的单位面积肌纤维量与nos2a+/+斑马鱼的无显著差异(P=0.718，图 3)。
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图 3 肌纤维密度比较 Fig. 3 Comparison of muscle fiber density |
由侧面及背面观察，nos2a-/-斑马鱼的躯椎骨发育较nos2a+/+斑马鱼无异常(图 4a)。躯椎骨横截面数据比对中，nos2a-/-斑马鱼在躯椎骨圆截面的横向径长W(P=0.548)、纵向径长H(P=0.817)及横截面积S(P=0.548)较nos2a+/+斑马鱼均具有增大的趋势，但差异未达到统计学意义上的显著水平(图 4b)。
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图 4 躯椎骨发育对比 Fig. 4 Comparison of vertebrae development |
为了检测nos2a突变对斑马鱼生长激素mRNA水平的影响，通过基因的荧光定量技术分别对生长差异凸显前(8 dph)后(68 dph)斑马鱼的生长激素及类胰岛素生长激素基因(gh1和igf1)进行检测(图 5)，发现nos2a-/-斑马鱼基因的mRNA水平均显著低于nos2a+/+斑马鱼，8 dph：P(gh1)＜0.01，P(igf1)＜0.001；68 dph：P(gh1)＜0.000 1，P(igf1)＜0.000 1。
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*P＜0.05;**P＜0.01。 图 5 nos2a敲除导致斑马鱼生长激素mRNA水平下降 Fig. 5 Knockout of nos2a reduced the expression of growth hormones in brain |
目前针对nos2的研究多集中于其对免疫系统的调控上[27]，而对机体生长的影响鲜有报道, nos2基因的敲除也多见于对哺乳动物如小鼠的研究。利用CRISPR/Cas9技术构建了可稳定遗传的nos2a基因纯合突变型(nos2a-/-)斑马鱼家系(图 1)。
对nos2a-/-斑马鱼的生长激素mRNA水平、体型增长趋势及肌肉、躯椎骨发育的特征进行分析，发现nos2a-/-斑马鱼与nos2a+/+斑马鱼的生长差异主要出现在出膜2个月后，并持续到生长停滞阶段(图 2)。生长类激素中，Gh由脑垂体分泌，Igf则在脑、肝脏、肌肉等多种组织中都有表达[28]，两者与机体的骨骼和肌肉的生长调节密切相关，这不仅在哺乳动物中有许多研究[1, 29-30]，在鱼类中同样得到了验证[31]，有研究发现Gh对鱼类生长的促进作用部分是通过Igf传递的[32-35]，而且Gh和Igf在刺激鱼类软骨发育中具有协同作用[36-37]。笔者发现，nos2a+/+斑马鱼的gh1和igf1的mRNA水平显著高于nos2a-/-斑马鱼(图 5)，这表明nos2a-/-斑马鱼的体型增长趋势受限(图 3)可能与其较低的生长类激素水平有关，并且从侧面印证了相关研究报道的NO在生长激素分泌和水平提升方面的促进作用[1-3]；然而，具有较低的gh1和igf1 mRNA水平的nos2a-/-斑马鱼在肌纤维密度及躯椎骨相关数据上较nos2a+/+斑马鱼无显著差异(图 3和4)，考虑到nos2基因在斑马鱼中有2个拷贝(nos2a和nos2b)且同在大脑及肌肉等组织中表达[38]，笔者猜测2个拷贝间可能存在功能补偿机制，且该机制可能是nos2a功能缺失未能引起肌肉和椎骨发育发生显著变化的原因，对此仍有待验证。此外考虑到激素调节的复杂性[39-42]，在之后的研究中，有必要对相关激素调节通路上的激素受体及相关调节因子的水平及作用进行深入调查。研究还发现，突变斑马鱼生长相关激素的基因mRNA水平在8 dph和64 dph时均显著低于对照组，而两者生长上的差异则主要凸显于出膜后2个月附近，因此认为生长激素不足对生长的影响是一个效应累积的过程。不过考虑到本研究仅通过基因mRNA水平反映激素水平变化具有一定局限性，因此有待在今后的研究中从蛋白水平对其进行进一步验证。
此外，从躯椎骨数据的分布(图 4b)看，nos2a-/-斑马鱼在躯椎骨的发育上较nos2a+/+斑马鱼有增粗的趋势，这与nos2基因敲除型小鼠骨吸收功能缺陷[20]以及nos1基因敲除型小鼠表现出骨转换水平下降及骨量增加[12]的报道相吻合，可见骨骼生长发育不只受生长类激素的调控，还与成骨、骨更新等过程的相关调节密切相关。
综上，nos2a的功能缺失对斑马鱼生长激素、类胰岛素类生长因子的mRNA水平及斑马鱼的生长具有负面调节作用。
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Role of nos2a in regulating the growth of zebrafish (Danio rerio)
1.
Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources, Ministry of Education, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China;
2. National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China
2. National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China
Abstract:
To explore the role of inducible nitric oxide synthase (Nos2) in fish growth regulation, we generated nos2a deficient (nos2a-/-) zebrafish using CRISPR/Cas9 technology for the first time. By monitoring their growth process, we found the growth trend of nos2a-/-zebrafish was slower than nos2a+/+zebrafish, and the adult body size of nos2a-/-zebrafish was smaller than that of nos2a+/+zebrafish (P < 0.01): the mean length and weight of nos2a+/+zebrafish were 29.53 mm and 512.8 mg, respectively, that of nos2a-/-zebrafish was 26.34 mm and 394.4 mg. Additionally, there was no notable difference in the density of muscle fibers (P=0.718) and sectional area of vertebrae (P=0.548)between nos2a+/+ and nos2a-/-zebrafish. Moreover, compared with nos2a+/+zebrafish at 8 dph (days post hatching), the mRNA level of growth hormone (gh1, P < 0.01) and insulin-like growth factor-1 (igf1, P < 0.001) of nos2a-/-zebrafish at 8 dph were lower significantly; and it was the same as that at 68 dph: gh1, P < 0.000 1; igf1, P < 0.000 1. These findings indicate that the defect of nos2a negatively affected zebrafish growth, and the reduced gene mRNA level of growth hormone was the potential factor.
Key words:
nitric oxide synthase
zebrafish
knockout
growth hormone
growth