2021,
Vol. 30
2. 上海海洋大学 上海水产养殖工程技术研究中心, 上海 201306;
3. 浙江省海洋水产养殖研究所, 浙江 温州 325005
紫菜(Pyropia)因味道鲜美、营养价值高，被人们广泛食用，在中日韩三国被大规模栽培[1]。紫菜栽培不仅产生了较大的经济价值，而且对栽培海区的生态修复也具有重要作用[2]。目前，在我国被大规模人工栽培的紫菜有温水性的坛紫菜(P. haitanensis)和偏冷水性的条斑紫菜(P. yezoensis)，前者主要在福建、浙江和广东三省栽培，后者栽培于江苏和山东二省。2016年，我国紫菜干品产量约13.53万t，产值达100亿元以上[3]。为满足生产与社会多元化的需求，在育种技术的不断进步与选育工作的逐步推进下，已选育出多个优质高产的紫菜新品系(种)[4-8]。其中，DING等[9]采用紫外线人工诱变技术，选育出坛紫菜新品系SW-81，该品系具有产量高、品质好、耐高温且壳孢子放散量大等优点，适于生产上大规模栽培，有望被培育成可推广的新品种。
随着紫菜新品系(种)的日益丰富，形态标记越来越难以满足其种质资源的管理，而分子标记技术为紫菜种质的快速鉴定提供了新的技术手段[10]。DNA指纹图谱技术是紫菜种质鉴定与遗传多样性分析的重要手段，RAPD、AFLP、SRAP以及SSR等技术均可用于构建紫菜的DNA指纹图谱[10]。其中，SSR分子标记由于具有多态性高、结果可靠等优点，成为构建指纹图谱最理想的分子标记[11]。但由于SSR引物的开发成本较高，目前已开发的SSR标记数量并不多，且多用于条斑紫菜，坛紫菜中SSR标记仍有着巨大的开发潜力。
本研究根据坛紫菜转录组序列信息进行EST-SSR标记的批量开发，并利用所开发的多态性SSR标记构建坛紫菜品系的DNA指纹图谱，一方面丰富紫菜的SSR标记库，为紫菜的分子生物学研究提供更多的标记选择，另一方面也为坛紫菜新品系 SW-81 的种质鉴定提供可靠的方法。
1 材料与方法 1.1 实验材料实验所使用的5个坛紫菜品系，其名称、代码如表 1所示。上述品系均以自由丝状体的形式被保存于本实验室内，保存条件：温度(20±1) ℃，光照密度2 μmol photons/(m2·s)，光照周期10L∶ 14D，每半年更换添加MES[12]培养基的灭菌海水。各品系叶状体的培养方法同文献[13]，取体长为10~15 cm的叶状体用于提取DNA。
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表 1 EST-SSR标记的开发实验所用的坛紫菜品系 Tab.1 Strains used in the development experiments of EST-SSR marker in P. haitanensis |
取健康生长的丝状体和叶状体，经灭菌的ddH2O清洗后，采用改进后的LiCl法提取它们的基因组DNA，并用CTAB法加以纯化[14]，通过测定OD值和1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。
1.3 转录组数据来源坛紫菜转录组数据来源于本课题组对坛紫菜野生型品系(WT, PT-001)进行Illumina高通量深度测序的结果[15]。测序样本为低盐处理不同时间段(3、6和9 h)的坛紫菜叶状体，提取RNA后委托北京诺禾致源生物信息科技有限公司进行RNA-Seq转录组测序，并通过de novo法组装得到33 872条Unigene作为分析背景数据。
1.4 转录组SSR位点的鉴别与SSR引物设计采用MISA软件(http//:www.pgrc.ipk-gatersleben.de)对聚类后的EST搜索SSR，搜索单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸最少重复次数分别为10、6、5、5、5和5次，包括中间被少数碱基打断的(interrupted)不完全重复的SSR。
用Primer 5.0引物批量设计程序对含有SSR位点的Unigene序列设计引物，并且SSR位点侧翼序列长度≥ 50 bp。引物设计的主要参数：退火温度(Tm)为50 ~ 65 ℃，上、下游引物的Tm相差≤ 2 ℃；PCR产物大小为100~500 bp；引物长度为18 ~ 28 bp；GC含量为40% ~ 60%，尽量避免引物二级结构如发卡结构、二聚体、错配和引物二聚体的出现。
对批量设计的SSRs引物对在Unigene库中进行SSR引物的Blast验证。
1.5 EST-SSR引物筛选随机选取187对EST-SSR引物交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。纯化后的丝状体DNA被稀释至20 ng/μL作为模板，进行PCR扩增。15 μL反应体系包括：20 ng/μL的DNA模板2 μL，Taq Mix 7.5 μL，10 μmol/L的Primer-F及Primer-R各0.4 μL，加ddH2O至15 μL。
PCR反应在Eppendorf AG 22331 Hamburg型热循环仪上进行。反应程序：94 ℃预变性5 min；接40个循环：94 ℃变性30 s，退火(温度视引物而定)30 s，72 ℃延伸30 s；最后延伸10 min，4 ℃保温。PCR扩增后的产物先在1%琼脂糖凝胶中检测，随后利用6%非变性聚丙烯酰胺凝胶于垂直电泳槽中电泳分离，电泳条件：电压为150 V，时间为4 h。最后利用银染显色法对电泳产物进行检测。电泳后采用银染的方式进行显色，并用BIO-RAD凝胶成像系统拍照记录。
1.6 数据统计分析根据聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果，选择清晰稳定、再现性强的条带进行统计，不同扩增产物的迁移位置标记为不同的位点。按照位点的单一与否可以将试验引物分为3类。(1)无效引物：100~500 bp未出现扩增条带，或条带杂乱；(2)有效引物：100~500 bp可扩增出预期条带，条带规律，各品系带型或多态或单一；(3)多态引物[16]：预期范围内扩增出规律性条带，扩增产物在各品系之间存在着微小的差异，表现为多态性。
1.7 构建DNA指纹图谱根据电泳检测图像统计并分析扩增位点处条带的有无，分别赋值1和0，有带记为1，无带记为0，形成1/0矩阵。遵循最少引物、位点且能区分所有品系的原则[17]，挑选核心引物，建立5个坛紫菜品系的丝状体DNA指纹图谱，每个品系3个重复，使得每个品系均有独特的指纹模式可区别于其他品系。
1.8 DNA指纹图谱的稳定性验证从室内培养的叶状体中，每个品系随机选择3颗进行基因组DNA的提取，利用上述核心引物对各品系叶状体DNA进行PCR扩增，检验该引物用于紫菜叶状体鉴定时的稳定性。
2 结果 2.1 坛紫菜各品系的丝状体和叶状体DNA的电泳检测从5个品系的丝状体(图 1)和叶状体(图 2) 中提取的DNA条带清晰，经1%琼脂糖凝胶电泳检查后，确定DNA的分子量为23 kb，NanoDrop 2 000测定结果表明，各品系DNA的OD260/OD280均在1.8左右，可满足SSR-PCR扩增的要求。
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M. λDNA/Hind Ⅲ marker; 1. SW-81; 2. HR-5; 3. WD-7; 4. SF-2; 5. WT-10。 图 1 5个坛紫菜品系的丝状体DNA在1% 琼脂糖凝胶电泳上的电泳结果 Fig. 1 Agarose gel photograph of genomic DNA extracted from the conchocelis of five strains in Pyropia haitanensis |
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M. λDNA/Hind Ⅲ marker; 1~3. SW-81; 4~6. HR-5; 7~9. WD-7; 10~12. SF-2; 13~15. WT-10。 图 2 5个坛紫菜品系的叶状体DNA在1%琼脂糖凝胶电泳上的电泳结果 Fig. 2 Agarose gel photograph of genomic DNA extracted from blades of five strains in Pyropia haitanensis |
通过对坛紫菜转录组中的33 872条Unigenes(序列总长约36 571.80 kb)序列进行搜索，找到9 033个符合条件的SSR，出现频率(检出SSR个数与总Unigene数之比)为26.67%。坛紫菜转录组的SSR种类较为丰富，二核苷酸至六核苷酸重复类型均存在，但各种类型的出现频率有较大差异(表 2)。其中：三核苷酸重复出现的频率最高，占总SSR的95.00%；其次是二核苷酸、四核苷酸和六核苷酸重复类型，分别占总数的4.21%、0.58%和0.14%。
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表 2 坛紫菜EST-SSRs的类型、数量及分布频率 Tab.2 Type, number and frequency of EST-SSRs in Pyropia haitanensis |
坛紫菜转录组中SSR位点重复次数以5次(5 695)最多，占总SSR的63.05%；紧接着重复次数为6、7、8和9次的SSR位点个数分别为2 723、525、48和13个，分别占到总数的30.15%、5.81%、0.53%和0.14%；而统计的≥10次重复的SSR位点共有29个，占总数的0.32%。
2.3 坛紫菜转录组SSR基序重复类型和频率特征坛紫菜SSR核苷酸基序类型(表 3)，二、三、四、五、六核苷酸的重复次数分别为380、8 581、52、7和13。SSR以三核苷酸重复基序为主要类型，占总SSR的95.00%，在三核苷酸重复基序中又以CCG、CGC、GCC、GGC、GCG和CGG亚型最多，为7 772条，占该类型总数的90.57%；其次是二核苷酸重复基序，以CG/CG类型最多，为259条，占该类型总数的68.16%，而AC/GT最少，仅出现2次。四、五和六核苷酸重复基元类型较多，但数量较少，出现频率均较低。
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表 3 坛紫菜转录组中SSR序列数量、类型及分布 Tab.3 Summary of quantity, type and distribution of SSR in transcriptome of Pyropia haitanensis |
对9 033个含SSR位点的EST序列进行引物设计，共设计了1 758对SSR位点特异引物。为了验证这些引物的有效性，随机挑选合成了187对EST-SSR引物，包括二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸及六核苷酸重复类型的SSR位点。以5个坛紫菜品系的基因组DNA为模板，对这批引物进行PCR扩增与筛选。通过多次筛选，共得到92对引物可产生理想的PCR产物，有效扩增率达到49.20%，表明其通用性较高(表 4, 5)。其中, 42对引物在不同的品系间呈现出不同的带型，为多态性引物，多态扩增率约为22.46%(表 5)。
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表 4 有效EST-SSRs引物信息 Tab.4 Valid EST-SSRs primer information |
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表 5 多态性EST-SSRs引物信息 Tab.5 Polymorphic EST-SSRs primer information |
图 3为有效引物(F50、F54和F103)在坛紫菜各品系中的扩增，在所选用的品系间并没有表现出扩增产物的差异，具有高度的普遍性和一致性；图 4为多态性引物(F44、F76和F133)在坛紫菜各品系中的扩增，可清楚地观察到不同品系间带型的差异，表明所开发的EST-SSR引物可用于坛紫菜生物多样性分析。
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M.100 bp DNA ladder; 1. SW-81; 2. HR-5; 3. WD-7; 4. SF-2; 5. WT-10。 图 3 有效引物F50, F54, F103在坛紫菜不同品系间的扩增条带 Fig. 3 Amplified band of effective primers F50, F54, F103 among different strains of Pyropia haitanensis |
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M. 100 bp DNA ladder; 1. SW-81; 2. HR-5; 3. WD-7; 4. SF-2; 5. WT-10。 图 4 多态性引物F44, F76, F133在坛紫菜不同品系间的扩增条带 Fig. 4 Amplified band of polymorphic primer F44, F76, F133 among different strains of Pyropia haitanensis |
依据使用最少位点、最少引物的原则，从42对多态性EST-SSR引物中筛选出1对引物(F76)，序列F：CCTCCCTCCCTCTACCCTTG；R: CAGCAGTGTCTCCCGTACG。以5个坛紫菜品系的丝状体DNA为模板，在该引物的PCR扩增下出现了3种不同的扩增位点，大小分别约为290、192和127 bp。如图 5所示，HR-5、WD-7和WT-10品系均仅出现1个条带，而SW-81和SF-2则均呈现出两个条带，其中SW-81品系为290和192 bp扩增组合，SF-2为192和127 bp的扩增组合。每个品系具有不同的位点组合，构成了其独特的指纹模式，由此构建出了适用于该5个坛紫菜品系的SSR-DNA指纹图谱。
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M. 100 bp DNA ladder; 1~3. SW-81; 4~6. HR-5; 7~9. WD-7; 10~12. SF-2; 13~15. WT-10。 图 5 用引物F76对不同坛紫菜品系的丝状体DNA扩增结果 Fig. 5 Amplification results by primers F76 in conchocelis DNA of different strains in Pyropia haitanensis |
利用引物F76的3种扩增位点转化出各坛紫菜品系的DNA指纹图谱(图 6)。另外，按条带的有无，将每个位点的条带转化为二进制码(表 6)。
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M.100 bp DNA ladder; 1. SW-81; 2. HR-5; 3. WD-7; 4. SF-2; 5. WT-10。 图 6 5个坛紫菜品系的DNA指纹图谱 Fig. 6 DNA fingerprints of five strains of Pyropia haitanensis |
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表 6 5个坛紫菜品系的指纹二进制码 Tab.6 DNA fingerprints binary codes of five strains of Pyropia haitanensis |
5个坛紫菜品系的叶状体DNA在F76引物的扩增下出现了与丝状体相对应的扩增条带，表明该指纹图谱同样适用于紫菜叶状体的种质鉴定，不受细胞倍性变化的影响。
3 讨论 3.1 坛紫菜转录组中微卫星位点的分布特征近年来，随着测序成本的降低以及各大数据共享平台的出现，不断完善的EST数据库成为SSR标记开发的又一重要来源。本研究利用坛紫菜转录组测序信息，从获得的33 872条Unigenes中共检测到9 033个微卫星位点。通过统计不同类型微卫星位点的出现频次，发现：三核苷酸重复类型的数量最多，占比高达95.00%，为绝对优势基元类型，其中以CCG, CGC, GCC, GGC, GCG, CGG亚型最多；其次为二核苷酸重复类型(CG/CG类型最多)，而五、六核苷酸重复类型出现频次很少。关于EST-SSR类型的分布特点，三核苷酸重复类型在大多数物种中均占有绝对的优势，二核苷酸重复类型次之[18]。对于同一紫菜属中的甘紫菜(Pyropia tenera)和列紫菜(Pyropia seriata)也具有类似的研究和报道：甘紫菜中三核苷酸重复类型占总微卫星位点的90.20%[19]；而列紫菜中同样也是三核苷酸重复类型居多，占比94.10%[20]。由此可见，紫菜基因组中不同类型SSRs的分布并不是均匀的，在重复类型和碱基组合上具有明显的“偏好性”。
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M. 100 bp DNA ladder; 1~3. SW-81; 4~6. HR-5; 7~9. WD-7; 10~12. SF-2; 13~15. WT-10。 图 7 用引物F76对5个坛紫菜品系叶状体DNA的扩增结果 Fig. 7 Amplification results by primers F76 in blades DNA of different strains of Pyropia haitanensis |
此外，对于二、三核苷酸重复类型在微卫星中占据绝对优势，有研究[21]表明，核苷酸重复单元在生物的基因层面发挥着重要的作用，尤其在转录区，三核苷酸相对于其他类型的SSR单元，有利于减少移位突变的可能性，保持基因的稳定性。另一方面微卫星涉及到很多重要的功能基因，例如：三核苷酸CCG编码的脯氨酸可参与到细胞代谢、基因表达的各个方面，包括能量转化、物质运输和信号传导等[22]；二核苷酸重复基元中的AG/CT亚型，在不同的阅读起点下可以被翻译为精氨酸(Arg)、谷氨酸(Glu)、丙氨酸(Ala)和亮氨酸(Leu)，蛋白质中具有丰富的丙氨酸和亮氨酸[23]。目前，对于微卫星序列在基因组中功能的探索已积累了部分数据，但更为确切的作用机制仍有待于进一步的深入。
3.2 EST-SSR标记的多态性分析引物的多态性反映了所含信息量的多少，是衡量引物质量的重要指标，多态性高的引物能够揭示更多的基因信息。相关研究[24-25]表明，微卫星标记的多态性与微卫星核心重复序列的长度成正比：当SSR核心基元长度大于20 bp时，呈现出较高的多态性；其次为核心基元长度在12~20 bp的SSR，多态性较低；而当核心基元序列长度小于12 bp的SSR，多态性最低。本研究用坛紫菜的丝状体DNA对187对SSR引物进行了验证，筛选到有效引物92对，经统计，其中42对引物在不同坛紫菜品系间具有扩增差异，多态扩增率为22.46%，平均每个多态性引物具有1~2条扩增条带。相对而言，本实验开发的EST-SSR标记的多态性程度并不高，可能与本实验选用的材料均为坛紫菜，种内差异性小有关[26]。
EST-SSR标记作为DNA编码区的一部分，因此多态性并不高，但其呈现的多态性较为稳定，重现性好，具有较强的实际应用价值[27]。吴文婷等[28]利用68对微卫星引物对坛紫菜、半叶紫菜(Pyropia katadai)、条斑紫菜、少精紫菜(Pyropia oligospermatangia) 和皱紫菜(Pyropia crispata)等5个紫菜属物种的丝状体进行遗传分析，其结果表明微卫星引物在同一属的不同的物种之间具有良好的通用性和遗传分辨力。因此，开发的多态性EST-SSR引物不仅可作为坛紫菜的种质鉴定，还可利用SSR标记的种间通用性为其他紫菜属物种提供可靠的标记资源。
3.3 SSR-DNA指纹图谱的构建DING等[9]利用紫外线人工诱变技术，筛选出坛紫菜新品系SW-81，后者具有高产、色素蛋白含量高、耐高温且壳孢子放散量大等优点，为了将该品系培育成为可推广的新品种，需要获得该品系可有效区别与其他品系的特征标记，用于种质鉴定和产权保护。DNA指纹图谱构建的关键是选择合适的核心引物，核心引物的多态性直接决定了指纹图谱质量，多态性越高，图谱的分辨率越好，图谱构建所需的核心引物的数量就越少[29]。本实验筛选到的引物F76多态性高，鉴别能力强，且带型易于分辨，利用它产生的3个不同的扩增位点，建立了5个坛紫菜品系的分子指纹图谱(图 6)，而且达到仅用一对引物即可将SW-81品系从试供坛紫菜品系中完全区分开的目的。
目前利用SSR标记构建指纹图谱在紫菜种质资源的鉴定和分析方面的应用较为广泛：谢潮添等[17]利用3对SSR引物(Phes08, Phes03和PC13)扩增出的16个多态性位点构建了44个坛紫菜种质材料的指纹图谱库；SUN等[30]通过开发多态性EST-SSR标记，构建了22个紫菜品系的DNA指纹图谱及其系统进化树。但是多数研究仅以紫菜的丝状体为实验对象进行鉴定，缺乏在叶状体中的稳定性和有效性评价。在本研究中，利用引物F76构建的多态性标记也可从试供的叶状体中稳定地鉴定出SW-81品系，进一步证明了该指纹图谱的稳定性和可重复性。
综上所述，本研究不仅开发了一批高质量的紫菜SSR分子标记，也为坛紫菜新品系SW-81的种质鉴定提供了有效的分子检测手段。
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