2020,
Vol. 29
2. 农业农村部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室, 上海 201306;
3. 上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心, 上海 201306;
4. 上海海洋大学 食品热加工工程技术研究中心, 上海 201306
副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus，Vp)是一种常见的嗜盐性革兰氏阴性菌，广泛分布于近海水域及海底沉积物中[1]，是我国海产品中最为常见的病原菌之一[2-3]。食用被该菌污染的水产品，可引起恶心、呕吐、腹泻等肠胃炎反应，严重的可能引发败血症甚至导致死亡[4]。近年来，副溶血弧菌还被证实是对虾肝胰腺坏死综合征的主要诱因[5]，严重危害对虾的质量安全，制约着对虾养殖业的可持续发展。
副溶血弧菌全基因组序列显示，该菌存在两种Ⅵ型分泌系统(type Ⅵ secretion system, T6SS)：位于1号染色体上的T6SS1和位于2号染色体上的T6SS2[6]。T6SS是近年来新发现的一种蛋白转运系统，与细菌的毒力和环境适应能力密切相关[7-9]。近期研究发现T6SS可帮助霍乱弧菌在种内和种间竞争中发挥优势[10-11]，并且有研究[12]表明副溶血弧菌的T6SS1与其生态位的竞争相关。然而，关于副溶血弧菌Ⅵ型分泌系统对其种内竞争的影响，研究尚属空白。
本研究针对这一空白，首先对85株副溶血弧菌的T6SS相关基因的携带情况进行了分析，并选取T6SS1+与T6SS1-的副溶血弧菌菌株进行混合培养，探究其种内竞争情况，同时运用qPCR技术分析混合培养后T6SS相关基因的表达情况，以期探究副溶血弧菌T6SS对其种内竞争的影响，为副溶血弧菌T6SS功能的进一步揭示提供科学的参考。
1 材料与方法 1.1 菌株来源选取本实验室分离自环境的41株菌株，其中3株(vps3、vps5、vps7)来自于中国科学院微生物研究所(Institute of Microbiology，Chinese Academy of Sciences，IMCAS)，1株(vps39)来自于美国疾病预防控制中心(Centers for Disease Control and Prevention，CDC)，其余37株均来自于上海市各水产市场的水产品中。其中tdh+基因型(tdh+/trh+和tdh+/trh-)菌株22株，tdh-基因型(tdh-/trh+和tdh-/trh-)菌株19株。44株临床分离株，其中42株来自于肠道门诊腹泻患者肛拭子样本，2株为标准菌株ATCC17802、ATCC33847由本实验室保存。其中tdh+基因型(tdh+/trh+和tdh+/trh-)菌株38株，tdh-基因型(tdh-/trh+和tdh-/trh-)菌株6株，所有菌株均为tlh阳性(种特异性基因)。基本信息如表 1所示。
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表 1 85株副溶血弧菌的基本信息 Tab.1 The information of 85 V. parahaemolyticus isolates |
硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐蔗糖琼脂培养基(Thiosulfate citrate bile salts sucrose agar culture medium，TCBS)、蛋白胨大豆琼脂培养基(Tryptic soy broth, TSB)和蛋白胨购自北京陆桥科技有限公司；DNA Marker购自宝生物工程(大连)有限公司，PCR Mix、琼脂糖和细菌基因组DNA提取试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司，动物总RNA快速提取试剂盒(Trizol-离心柱型)、反转录试剂盒和荧光定量试剂盒购于TaKaRa公司。以上试剂均在有效期内使用。
1.3 菌种活化及菌液制备将副溶血弧菌菌株从-80 ℃保存的甘油管中取出，划线接种于TCBS平板，37 ℃倒置培养12~16 h，挑取合适单菌落于10 mL TSB试管中(3% NaCl)，37 ℃、200 r/min摇床培养8~10 h，连续活化2次，作为DNA提取菌液备用。
1.4 副溶血弧菌基因组DNA的提取按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书对85株副溶血弧菌基因组DNA进行提取，将提取的DNA储藏于-20 ℃的冰箱中备用。
1.5 PCR引物与扩增条件引物设计：tlh，tdh，trh引物序列参考文献[13]合成。其他引物参考副溶血弧菌RIMD 2210633 (GenBank登录号: BA000032)基因序列，使用Primer 5.0软件设计，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。序列信息见表 2。PCR扩增条件：25 μL体系，95 ℃，4 min；94 ℃，1 min；退火30 s，退火温度见表 2；72 ℃，1 000 bp/min；30个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行验证，阳性对照由生工生物工程(上海)有限公司测序验证，所有实验均独立重复2次。
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表 2 引物序列信息 Tab.2 Information of primer sequences |
由于同种菌株之间的检测需要不同的目标基因，所以选取tdh和trh基因为目标引物和探针。每组选取1个tdh菌株与1个trh菌株进行混合培养，其中：tdh+菌株为vps2、vpc16、vps16(T6SS1+)和vpd18(T6SS1-)；trh+菌株为vps7(T6SS1+)，vpr108、vpr111和vpc18(T6SS1-)。
菌株活化2次，离心取沉淀，用蛋白胨水(Peptone water, PW，0.85% NaCl，0.1%蛋白胨)进行稀释，将OD600值调整至0.6左右，保证接种量一致。将其分为8组，第1组：vps2(T6SS1+)和vpr108(T6SS1-)；第2组：vpc16(T6SS1+)和vpr108(T6SS1-)；第3组：vps7(T6SS1+)和vpd18(T6SS1-)；第4组：vps7(T6SS1+)和vps16(T6SS1+)；第5组：vpc16(T6SS1+)和vpc18(T6SS1-)；第6组：vps2(T6SS1+)和vpr111(T6SS1-)；第7组，vpd18(T6SS1-)和vpr108(T6SS1-)；第8组，vps7(T6SS1+)和vpc16(T6SS1+)。按0.1%接种量将两株菌接种到同一10 mL TSB试管中，置于37 ℃摇床培养8 h后，取1 mL菌液按上述方法提取DNA，用于qPCR反应。
1.6.2 荧光定量PCR(qPCR)菌液活化2次，确定其OD600值后，用PW进行10倍梯度稀释，取合适浓度涂布于TCBS平板上，37 ℃过夜培养计数。同时取1 mL菌液进行DNA提取，-20 ℃冰箱保存备用。将平板涂布结果为109 CFU/mL的副溶血弧菌菌悬液进行10倍梯度稀释，获得终浓度为10~109 CFU/mL的菌液，分别取1 mL提取DNA后进行qPCR反应，输出相应的循环阈值(Ct值)作为标准曲线y轴。同时将菌液稀释涂布于TCBS培养基，计数结果作为x轴(log10CFU/mL)，构建该反应的标准曲线，并计算曲线的斜率(slope)，利用公式E=10-1/slope-1计算反应的扩增效率[14]。
选择副溶血弧菌tdh基因和trh基因作为荧光定量PCR的扩增靶基因，其中Taq Man探针分别标记为CY5和FAM作为荧光基团。本实验所使用的Taq Man探针以及相关引物根据参考文献[15]由上海英潍捷基公司合成。荧光定量PCR的反应体系为20 μL，包括10×PCR缓冲液2 μL，Mg2+缓冲液(50 μmol/μL) 1.2 μL，dNTPs Mix(10 μmol/μL)0.5 μL，正反向引物(10 μmol/μL)各0.5 μL，DNA模板1 μL，Taq酶0.2 μL，探针(10 μmol/μL)0.2 μL及ddH2O 13.9 μL。qPCR反应参数为：95 ℃预变性1 min；共40个循环，每个循环95 ℃，5 s；59 ℃，45 s。在延伸阶段收集荧光信号，反应结束后，对获得的信号数据进行处理。
1.7 T6SS相关基因表达量的检测荧光定量PCR的反应体系(20 μL)：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL，PCR Primer-F 0.8 μL (10 μmol/μL)，PCR Primer-R 0.8 μL (10 μmol/μL)，ROX Reference Dye 0.4 μL, cDNA模板2 μL及ddH2O 6 μL。PCR反应参数为：95 ℃预变性30 s；40个循环中，每个循环均95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s。
将16S rRNA基因定为副溶血弧菌的内参基因，其上下游引物5′端到3′端分别为gacacggtccagactcctac/ggtgcttcttctgtcgctaac[16]，参考副溶血弧菌RIMD 2210633 (GenBank登录号: BA000032)基因序列，使用Primer 5.0软件将T6SS相关蛋白基因作为靶基因设计引物，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物序列及基因功能信息见表 3。
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表 3 反转录荧光定量PCR反应引物序列信息 Tab.3 Information of qPCR primer sequences |
使用SPSS 19.0软件对数据进行单因素方差分析(ANOVA)，检验水平为P < 0.05时为差异显著，具有统计学意义。
2 结果与分析 2.1 T6SS基因携带情况分析选取T6SS1结构蛋白VipA1和T6SS2结构蛋白VipA2基因，以及4个T6SS1相关基因vp13885、vp1390、vp1393、vp1415 [17]进行检测。结果发现，在85株副溶血弧菌中，有62株携带T6SS1结构基因vipA1，其中临床分离株中有41株，占全部临床分离株的93.2%，而环境分离株中有21株，占全部环境分离株的51.2%，临床分离株中的而T6SS2结构基因vipA2在所有的副溶血弧菌中广泛存在。
所检测的4个T6SS1相关基因vp1388、vp1390、vp1393、vp1415在85株所测副溶血弧菌中只有34株为全部阳性，其余53株中均至少缺少1个T6SS1相关基因，并且这其中环境分离株的缺失程度明显大于临床分离株，说明T6SS1基因簇在不同来源副溶血弧菌中存在一定的差异性，检测结果见表 4。
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表 4 临床与环境分离株T6SS相关基因携带情况 Tab.4 Distribution of T6SS related genes for all 85 V. parahaemolyticus isolates from clinical and seafood sources |
以溶血素基因为依据，所检测的60株tdh+菌株(tdh+/trh+和tdh+/trh-)中，32株含有全部的T6SS基因，占53.3%；25株tdh-菌株(tdh-/trh+和tdh-/trh-)中只有2株含有全部的T6SS基因，占8.0%(2/25)，tdh菌株更倾向于含有完整的T6SS基因簇。以tdh+和tdh-为分组，T6SS1相关基因携带情况有显著性差异，P < 0.05，具有统计学意义，tdh+菌株比tdh-菌株携带更多的T6SS1相关基因，未发现trh基因与T6SS1有何相关性。
2.2 副溶血弧菌混合培养中的数量变化以已知菌数量的DNA建立标准曲线，标定Ct值与菌落数的关系。以tdh基因做标准曲线获得方程为y=45.929-3.75x，R2=0.990；以trh基因建立标准曲线方程为y=43.575-3.498x，R2=0.984；其扩增效率E在80%~120%之间，表明该方程能够较好地描述Ct值与菌落数的线性关系。见图 1。
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图 1 副溶血弧菌qPCR定量标准曲线 Fig. 1 Standard curves of qPCR for V. parahaemolyticus |
选取8株菌株，两两混合培养8 h，测定各菌株数量，其中：vps2、vpc16、vps16为T6SS1+菌株，vpd18为T6SS1-菌株，但4株菌都携带tdh基因，且不含trh基因，因此将tdh基因作为该菌株的标志基因进行细菌数量检测；菌株vps7为T6SS1+菌株，vpr108、vpr111、vpc18为T6SS1-菌株，4株菌都携带trh基因，且不含tdh基因，因此将trh基因作为标志基因进行细菌数量检测。
每组以相同接种量进行混合培养8 h后，用qPCR进行数量统计。由图 2可知：8组中有4组出现数量上的明显差异，携带T6SS1的菌株vps2、vpc16以及vps7在特殊组别中呈现出了明显的种内竞争力(组1、2、3、4)，1、2组中vps2和vpc16为优势菌株，3、4组中vps7为优势菌株，并且优势菌株数量范围在9.31~9.58 log10 CFU/mL，劣势菌只有3.27~3.98 log10 CFU/mL，统计学分析显示两菌株之间数量差异极显著，P < 0.01。而第5、6、7、8组在混合培养时，各菌株数量并未出现类似前4组的明显差异，其菌数量范围均在8.12~9.14 log10 CFU/mL之间，差异不显著，P>0.05。这一结果表明，在混合培养条件下，大部分携带T6SS1的副溶血弧菌存在明显的种内竞争优势，但并非所有的T6SS1+菌株都对T6SS1-菌株有明显抑制作用。T6SS1+菌株对T6SS1+菌株之间也可能存在竞争作用，vps7(T6SS1+)可以抑制vps16(T6SS1+)，但是vps7和vpc16(T6SS1+)混合培养后其数量差异不大。在T6SS1-菌株中并未发现具有竞争优势的菌株，当vpd18(T6SS1-)与vpr108混合培养，其数量差异不大，无显著性差异，P>0.05。
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*表示差异显著，**表示差异极显著 *means P < 0.05, ** means P < 0.01 图 2 混合培养条件下不同副溶血弧菌的数量变化 Fig. 2 A competition assay of different V. parahaemolyticus at a 1: 1 concentration |
提取培养8 h后的副溶血弧菌RNA，以单独培养时副溶血弧菌的基因表达量为参照，通过qPCR相对定量法(ΔΔCt)，观察T6SS相关基因(OmpA、VgrG、Hcp、VipB)表达变化。OmpA为T6SS的跨膜蛋白，介导分泌蛋白的跨膜转运，VgrG为T6SS1的转位蛋白，介导效应物的转移；Hcp为T6SS的转位蛋白，同时也是T6SS的结构蛋白，构成T6SS注射器结构，VipB是T6SS的结构蛋白。
较单一培养的菌株，混合培养8 h后的副溶血弧菌T6SS1相关基因OmpA1、Hcp1、VgrG1的表达量均有明显的上调，结果如图 3所示。图 4呈现了混合培养中副溶血弧菌T6SS2相关基因VipB2、Hcp2、VgrG2的表达情况，结果显示这些基因的表达量在混合培养条件下也都明显上调。导致这一现象的原因可能是，在混合培养的条件下，副溶血弧菌可通过增强自身T6SS1和T6SS2相关基因的表达，以应对其在混合培养中的种内竞争。
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*表示差异显著，**表示差异极显著 *means P < 0.05, ** means P < 0.01 图 3 混合培养后不同组副溶血弧菌T6SS1相关基因表达水平 Fig. 3 T6SS1 genes expression of qPCR analysis in V. parahaemolyticus |
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*表示差异显著，**表示差异极显著 *means P < 0.05, ** means P < 0.01 图 4 混合培养后不同组副溶血弧菌T6SS2相关基因表达水平 Fig. 4 T6SS2 genes expression of qPCR analysis in V. parahaemolyticus |
对85株副溶血弧菌的基因检测发现，大约90%的临床分离株携带T6SS1基因，而在环境分离菌株中，只有约一半的菌株携带部分所检测的T6SS1基因。针对T6SS1的主要结构蛋白进行调查，发现在副溶血弧菌临床分离株中的T6SS1基因存在比例要远远高于环境分离株，而T6SS2存在于所有的副溶血弧菌中。这一结果大致与之前的报道[17]一致，比例上的差异可能跟细菌的分类不同(按血清型分类或按分离来源分类)有关，也有可能与不同地区分离的细菌背景不同有关。
T6SS是近年来新发现的与细菌致病力和适应性密切相关的分泌系统，费氏弧菌可依赖Ⅵ型分泌系统杀死非致病菌株，从而进行种内竞争[18]。在霍乱弧菌中T6SS介导抗菌作用和种内竞争[19-20]，副溶血弧菌的基因组结构与霍乱弧菌的基因结构相似，因此，我们推测副溶血弧菌的T6SS在功能上可能与霍乱弧菌相似，与种内竞争相关[12, 21]。本研究通过混合接种的方式，进一步证实了该观点：部分T6SS1+的副溶血弧菌存在明显的种内竞争优势，混合接种条件下能够特异性地明显抑制其他同种菌株的生长繁殖。
在本实验条件下，有一部分T6SS1+的菌株可与T6SS1-菌株兼容共生，例如vpc16和vpc18，vps2和vpr111，并且在T6SS1+与T6SS1+菌株的混合培养组中，有1组出现了数量上的差异(vps16和vps7)，1组兼容共存(vps7和vpc16)。造成这一现象的原因可能是，这些菌株的T6SS1相关基因存在不同程度的突变或缺失，导致其种内竞争力不能很好地展现。针对研究结果，提出这样的推测：(1)副溶血弧菌针对的是一种细菌成分，这种成分在某些菌株中是不存在的，或者对某些菌株种类来说不是必需的，这可能和T6SS1相关基因存在不同程度的突变或缺失有关；(2)部分菌株能抑制T6SS1活性；(3)一些菌株对T6SS1的毒性具有抵抗力，例如霍乱弧菌和费氏弧菌的T6SS可以选择性的抑制同种菌株[12, 18]。
进一步分析T6SS1相关基因的表达情况，结果显示在混合培养之后，其相关基因表达量均上调，这证实了混合培养确实激活了T6SS1的表达。并且，研究表明T6SS2在混合培养后的基因相对表达量也显著上调，这是否说明T6SS2也参与混合培养下的种内竞争？本研究初步探究了副溶血弧菌Ⅵ型分泌系统对其种内竞争的影响，表明T6SS1的存在可明显地提升副溶血弧菌在混合培养中的生长能力，是其进行种内竞争的主要工具之一。但是在自然环境中，副溶血弧菌的种内竞争现象可能不只由T6SS1单一因素介导，可能是由于多种基因共同作用的结果，其作用机理还有待进一步研究。
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WANG Jingjing1,
LIU Haiquan1,2,3,4,
PAN Yingjie1,2,3,
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2. Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment for Aquatic Product on Storage and Preservation, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Shanghai 201306, China;
3. Shanghai Engineering Research Center of Aquatic Product Processing & Preservation, Shanghai 201306, China;
4. Engineering Research Center of Food Thermal-Processing Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China