七彩神仙鱼(Symphysodon haraldi)原产于南美亚马逊河流域，因其独特外形和艳丽色彩，有着热带观赏鱼之王的美称^[1]。七彩神仙鱼具有独特的抚育行为，即仔鱼在孵化后会以亲鱼体表分泌的黏液为食，俗称“喂奶”。亲鱼“乳汁”分泌质量会直接影响仔鱼的生长与成活。因此，查明七彩神仙鱼繁殖期体表黏液组分变化，提升“乳汁”分泌品质，对七彩神仙鱼健康苗种繁育具有重要意义。目前，国内外有关七彩神仙鱼抚育行为的研究已有较多报道^[2-4]，但对于七彩神仙鱼体表黏液组成尤其是抚育期“乳汁”成分变化的研究较少。

本研究将调查七彩神仙鱼雌、雄亲鱼繁殖周期内体表黏液中皮质醇、免疫球蛋白M、总蛋白、乳酸和葡萄糖的变化规律，并通过变化情况来评估其“喂奶”能力。

1 材料与方法 1.1 实验亲鱼

选取规格统一且来自同一窝的10对七彩神仙鱼亲鱼，由上海海洋大学观赏水族实验室提供。将七彩神仙鱼一个完整繁殖周期分为6个阶段，包括繁殖间期、产卵期、孵化期、平游期、平游1周、平游2周。其中产卵期、孵化期、平游期、平游1周、平游2周可统称为繁殖期(表 1)。

1.2 样品采集与检测

从亲鱼处于繁殖间期开始便对其进行黏液采集，直至6个繁殖阶段全部完成。采集时用灭菌的镊子夹取已称重的脱脂棉在鱼体表面进行擦拭，吸附黏液后将其放入已称重的1.5 mL离心管，保存于-80 ℃冰箱中，用于皮质醇、免疫球蛋白M、总蛋白、乳酸与葡萄糖的含量测定。检测方法按照皮质醇酶联免疫试剂盒、免疫球蛋白M酶联免疫试剂盒、BCA法蛋白定量测定试剂盒、乳酸试剂盒和葡萄糖测定试剂盒(中国，南京建成)的操作说明进行。

1.3 数据处理与分析

采用Kolmogorov-Smirnov检验和Levene检验对原始数据进行正态分布和方差齐性分析。对5种指标进行雌雄性别与繁殖时期的双因子方差分析(SPSS 20.0)。数据结果均以平均值±标准差表示。

2 结果 2.1 体表黏液皮质醇含量变化

七彩神仙鱼繁殖周期内皮质醇含量受繁殖时期与性别的影响显著(表 2)。在平游期，雌鱼体表黏液皮质醇含量显著高于雄鱼，而在其他时期，雌雄间的差异不显著。雌雄鱼体表黏液中皮质醇的含量均表现出先降后升再下降的趋势(图 1)。

2.2 体表黏液免疫球蛋白M含量变化

七彩神仙鱼繁殖周期内体表黏液免疫球蛋白M受繁殖时期与性别的影响显著(表 2)。在平游期，雄鱼体表黏液免疫球蛋白M质量浓度显著高于雌鱼，而在其他时期，雌雄间的差异不显著。雌雄鱼体表黏液中免疫球蛋白M的质量浓度均表现出下降、上升、再下降的趋势(图 2)。

2.3 体表黏液总蛋白含量变化

七彩神仙鱼繁殖周期内体表黏液总蛋白质量浓度受繁殖时期与性别的显著影响(表 2)。在繁殖期间、孵化期、平游期雄鱼体表黏液总蛋白质量浓度显著高于雌鱼，而在其他时期，雌性显著高于雄性。雌雄鱼体表黏液中总蛋白的含量均表现出下降、上升、再下降的趋势(图 3)。

2.4 体表黏液乳酸含量变化

七彩神仙鱼繁殖周期内体表黏液乳酸浓度受繁殖期与性别的影响显著(表 2)。在平游期与平游1周，雄鱼体表黏液乳酸浓度显著高于雌鱼，而在其他时期，雌雄差异不显著。雌鱼体表黏液中乳酸的浓度表现为逐渐下降的趋势。雄鱼体表黏液中乳酸的浓度表现为下降、上升、再下降的趋势(图 4)。

2.5 体表黏液葡萄糖含量变化

七彩神仙鱼繁殖周期内体表黏液葡萄糖质量浓度受繁殖时期与性别的影响显著(表 2)。在平游期雄鱼体表黏液葡萄糖质量浓度显著高于雌鱼，而在其他时期，雌雄差异不显著。雌雄鱼体表黏液中葡萄糖的质量浓度均表现出下降、上升、再下降的趋势(图 5)。

3 讨论 3.1 七彩神仙鱼繁殖周期内皮质醇变化

皮质醇属于糖皮质类激素，参与调节鱼类体内多种生理生化反应，如物质代谢、渗透压、免疫功能、性腺成熟等^[5-6]。大多数鱼类在受到外源性刺激后，血浆中的皮质醇会在0.5至1.0 h后达到峰值^[7]。有研究已经阐述了部分鱼类体表黏液中皮质醇的分泌机制，如海鲈鱼(Dicentrarchus labrax)^[8]、鲤(Cyprinus carpio)^[9]、虹鳟等^[10]。不同鱼类体表黏液中的皮质醇水平存在明显的种间差异，七彩神仙鱼体表黏液中皮质醇质量浓度为20~60 ng/mL，这一结果与方尾白菇鱼(Argyrosomus regius)体表黏液的测量值相近^[7]。本实验中的皮质醇除平游期外，其他繁殖阶段的含量都相近。这说明七彩神仙鱼在整个繁殖周期中，除平游期外，雌雄鱼的应激情况相接近。雄鱼在平游期出现了皮质醇明显降低的情况，但雄鱼免疫球蛋白M、总蛋白、葡萄糖和乳酸在这一时期反而出现了一个明显升高的情况。可以推测皮质醇含量的升高可能对上述4种物质的分泌有抑制作用。在平游2周时雌雄皮质醇都出现了下降。这与在养殖过程中所观察到的仔鱼在上身14 d左右离开亲鱼开始独立觅食的时间相吻合。当仔鱼开始独立觅食，仔鱼对亲鱼体表的啄食频率也逐渐变少，对亲鱼的刺激减弱，这与文献[2]中所描述的情况类似。

3.2 七彩神仙鱼繁殖周期内免疫球蛋白M变化

鱼类的免疫分为非特异性免疫和特异性免疫，而无颌类鱼类体内只有非特异性免疫的存在，有颌类则两者兼具^[11-12]。鱼类的特异性免疫通过免疫球蛋白(immunoglobulin, Ig)与T淋巴细胞(T-lymphocyte)来完成^[13]。其中免疫球蛋白是在鱼类特异性免疫中发挥作用的主要物质。虽然相关研究中已经报道过硬骨鱼类拥有4种免疫球蛋白，IgM、IgD、IgZ与IgT，但只有IgM在硬骨鱼类的特异性免疫过程中发挥作用^[11-13]。国内外对皮肤黏液中的IgM已经有了相当多的研究，如南亚野鲮(Labeo rohita)、印度鲤(Catla catla)^[14]、鳜(Siniperca chuatsi)^[15]、鲤^[16]等。在哺乳动物哺乳时雌性会通过乳汁为幼崽提供免疫物质, 其中包括免疫球蛋白M，这样能在哺乳动物幼崽还没有建立成熟的免疫系统时为其提供保护^[17]。由此推测七彩神仙鱼亲鱼体表黏液中的免疫球蛋白M也有类似的作用。虽然我们还不了解七彩神仙仔鱼多久可以建立起自身成熟的免疫系统，但根据平游2周亲鱼体表黏液中免疫球蛋白M都有一个明显的下降来推测，平游2周时可能仔鱼已经建立起了比较完整的免疫系统。斑马鱼仔鱼要4~6周来建立自己的免疫系统^[18]。七彩神仙鱼的免疫球蛋白M由亲鱼直接提供，其周期可能更短。更高的免疫球蛋白M可能是亲鱼为了应对仔鱼啄食所带来的表皮损伤^[2]。由于免疫球蛋白M是蛋白质的一种，因此免疫球蛋白M的多寡与总蛋白的多寡有很大的相关性。在本实验中，免疫球蛋白M呈现下降-上升-下降的规律。其中繁殖间期到孵化期这一阶段免疫球蛋白M出现下降，经观察与七彩神仙在这一时期体色明显变深的现象相吻合，这可能是七彩神仙鱼体内相关激素含量变化所导致的。除平游期外雌雄差异不显著，平游2周后雌鱼的免疫球蛋白M含量显著下降，这与亲鱼在两周左右结束“喂奶”的现象相吻合。

3.3 七彩神仙鱼繁殖周期内总蛋白变化

鱼类体表黏液主要成分为水，含水量90%以上^[19]。而经过烘干后蛋白质占干质量的比例在50%以上，这些蛋白质主要包括免疫球蛋白、抗体、溶菌酶、凝集素、补体以及一些肽类^[12]。这些蛋白质是鱼类抵御外界病原侵害的第一道防线，是鱼类免疫系统的重要组成部分。另外体表黏液中还存在一些蛋白酶，例如组织蛋白酶、超氧化物歧化酶和胰蛋白酶等^[13]。鱼类受到外界刺激后，体表黏液会大量增多，而蛋白质作为黏液中除水以外的主要成分，其含量也会随之改变，因此有研究将体表黏液中总蛋白含量作为鱼体应激状况的评价指标^[7]。大多数对鱼类体表黏液的研究中，只研究其中的免疫球蛋白或进行蛋白组学的检测^{[4, 20]}。有文献[21]表明，感染会导致体表黏液中总蛋白含量的降低。本实验中总蛋白的含量都呈现下降-上升-下降的规律。平游期雄性的含量过高可能是个体间差异所造成，繁殖间期到孵化期这一阶段下降这一现象，经观察与七彩神仙鱼在这一时期内体色明显变深的现象相吻合。而在平游2周雌雄都有显著的下降，这与亲鱼在两周左右结束“喂奶”相吻合。雌雄鱼在整个繁殖周期中总蛋白含量交替升高。由此分析，以体表黏液中总蛋白的含量来衡量，除平游期外，七彩神仙雌雄之间“喂奶”能力差异不显著。

3.4 七彩神仙鱼繁殖周期内乳酸变化

当鱼类的有氧呼吸不能完全供给鱼体能量时，无氧呼吸就会启动，而葡萄糖经过无氧呼吸的代谢产物就是乳酸^[22]。因此乳酸升高则证明鱼类身体负担加重，乳酸含量越高，则无氧呼吸强度越大，因此乳酸含量的增加可以从一个方面反映出鱼体的应激程度与疲劳程度^[23]。有文献[22, 24]表明，当鱼类受到可以增加鱼体运动强度或者减少鱼体氧气利用率的胁迫时，鱼体血浆中的葡萄糖与乳酸会同步上升。方尾白菇鱼在受到胁迫后，血浆中乳酸的浓度峰值出现在胁迫1 h后，6 h后血浆中的乳酸浓度恢复到受胁迫之前的浓度^[4]。体表黏液中的乳酸浓度相对血浆会有时间上的滞后。七彩神仙鱼除雄性平游期外呈整体下降趋势。这说明其身体负担与应激程度在整个繁殖周期中在逐渐下降。前3个时期雌雄差异不显著，七彩神仙鱼雄性在平游期后显著高于雌性。由此推测以乳酸为衡量标准在开始“喂奶”后，七彩神仙鱼雄性“喂奶”能力强于雌性。

3.5 七彩神仙鱼繁殖周期内体表黏液葡萄糖变化

鱼类在能量代谢过程中主要通过细胞内的呼吸作用来进行供能，而葡萄糖就是最主要的呼吸作用的供能物质，因此恒定的血糖浓度对维持鱼类正常生命活动有重要的作用^[25-27]。但是与哺乳动物相比，鱼类对于食物中高含量的糖类具有不耐受的特点，具体表现为当鱼类摄入糖类后，血糖水平会大幅升高，并且持续较长时间。一般来说草食性鱼类对糖的耐受能力大于杂食性鱼类，杂食性鱼类大于肉食性鱼类^[28]。但鱼类对于低血糖的耐受能力较高^[25-26]。与哺乳动物类似，鱼类也是通过胰岛素和胰高血糖素这一对拮抗激素对血糖进行调节。有研究表明当鱼类饲料中糖类含量过高时会影响鱼类的生长。体表黏液中葡萄糖的浓度可以作为鱼体应激程度的评价标准^[25]。当环境出现变化时，鱼类会通过糖原异生和肝糖元分解两个通路来提高身体内葡萄糖的含量，从而为身体提供额外的能量^[27]。当鱼类处于压力状态时，鱼类血糖会升高，而血糖升高的程度与持续时间和鱼类种类有着很大的相关性^[29-30]。体表黏液中的葡萄糖也与鱼类的血糖表现出相关性^[4]。在本实验中葡萄糖与乳酸的变化趋势相类似，除雄性平游期外呈整体下降趋势，这与文献中所描述的乳酸与葡萄糖同步变化的现象相符合。除平游期外雌雄差异不显著。由此推测，以葡萄糖为衡量标准，七彩神仙鱼鱼体负担与应激程度逐渐降低，在开始“喂奶”后，除平游期外七彩神仙鱼雌雄鱼“喂奶”能力差异不大。

综上，进入繁殖期后七彩神仙鱼体表黏液中各成分含量变化显著。七彩神仙鱼雄鱼在平游期的“喂奶”能力显著优于雌鱼，但在平游1周与平游2周时雌雄鱼“喂奶”能力相差不显著。