2019,
Vol. 28
2. 上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心, 上海 201306
炎症是机体应对外来刺激的一种防御机制，是一种常见的病理过程[1]。然而长期的炎症反应或炎症反应过强则会诱导相关疾病的发生，如肝炎、痛风、动脉粥样硬化甚至是癌症等[2-5]。巨噬细胞是机体先天的免疫细胞，在炎症反应中起重要作用[6-7]。在LPS诱导的RAW264.7细胞中，toll-like受体4(TLR4)识别并结合LPS，进而促进炎症信号传导并诱导MAPK和NF-κB蛋白激酶的激活，导致MCP-1、IL-6、IL-1β和TNF-α等炎症因子的转录以及NO等炎性介质的释放，最终导致炎症反应[8-9]。
紫檀茋是近年来发现的一种优秀的抗氧化成分，主要存在于蓝莓、葡萄等水果中，天然来源的优势使得其在功能食品领域具有广阔的应用前景[10]。目前，关于紫檀茋的研究多集中在制备、合成和抗癌活性方面，尚未发现国内有针对紫檀茋抗炎活性的研究[11-13]。因此，本研究以LPS诱导RAW264.7巨噬细胞建立炎症模型，观察紫檀茋对炎症介质和炎性因子生成的影响，并对其抗炎机制进行进一步的探究，为紫檀茋合理开发利用提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 实验材料小鼠RAW264.7细胞株购自中国科学院上海细胞库；紫檀茋(Pterostilbene, Pte；纯度99%)购自中国杭州瑞树生化有限公司；脂多糖(L4391，0111：B4)购自美国Sigma公司；一氧化氮(NO)测定试剂盒购自中国南京建成生物工程研究所；Trizol试剂，PrimeScriptTM reagent Kit with gDNA Eraser逆转录试剂盒购自日本TaKaRa公司；Faststart Essential DNA Green Master实时定量PCR试剂盒购自瑞士Roche公司；一抗：anti-ERK1/2, anti-p-ERK1/2, anti-JNK, anti-p-JNK, anti-p38, anti-p-p38, anti-NF-kB p65, anti-NF-kB p-p65，二抗：HRP -Linked antibody购自美国Cell Signaling公司。
1.2 实验方法 1.2.1 RAW264.7细胞培养RAW264.7细胞使用含10%FBS、1%青链霉素的DMEM高糖培养基在37 ℃，5% CO2浓度中进行培养。细胞生长至80%~90%后进行传代，1~2 d换液1次、3~4 d传代1次。细胞传代3次，待细胞状态稳定后进行下一步实验。
1.2.2 RAW264.7细胞炎症模型的建立将处于对数生长期的RAW264.7细胞以2×106个/mL接种到6孔板中，每孔2 mL，置于细胞培养箱中使细胞稳定生长，待细胞贴壁后，随机分为4组，每个处理组设3个平行，分别加入0、50、100和200 ng/mL的LPS进行刺激24 h，促使细胞产生炎症因子。采用qPCR法检测LPS刺激的RAW264.7细胞中炎症因子MCP-1、IL-6、IL-1β和TNF-α表达量来确定LPS诱导炎症的合适浓度。
1.2.3 细胞活力的测定为避免加入的紫檀茋因浓度过大而导致细胞损伤，设置浓度梯度的紫檀茋，采用结晶紫染色法[14]检测紫檀茋对细胞存活率的影响，以确定最终实验浓度。将RAW264.7细胞以2×104个/mL接种到96孔板中，每孔200 μL，置于细胞培养箱中使细胞稳定生长，待细胞贴壁后，加入DMSO溶解的紫檀茋，浓度依次为0、5、10、15和20 μmol/L，每一浓度重复5孔，培养24 h后用结晶紫染色法染色，在酶联免疫检测仪(SynergyTM Mx，美国BioTek) 570 nm处测量各孔的吸光值。
1.2.4 NO释放量的测定LPS刺激RAW264.7细胞后会释放大量的NO，而NO化学性质活泼，在体内代谢很快转化为硝酸盐(NO3-)和亚硝酸盐(NO2-)，通过检测培养基中硝酸盐和亚硝酸盐含量来反映NO生成。调整细胞悬液浓度为2×105个/mL，接种于12孔培养板，待细胞长至60%~70%后，分为3组处理，分别为对照组、LPS处理组及LPS加紫檀茋组，每组设置3个平行，继续培养24 h。收集培养基，600 g离心5 min取上清，参照一氧化氮(NO)试剂盒说明操作，通过测定540 nm处吸光值来衡量培养基中NO的含量。计算公式如下：
(1)
式中：C-为NO2-/NO3-含量, μmol/L；An为样品的测定OD值；A0为空白OD值；A为标准品的OD值；C为标准品的浓度, 100 μmol/L；n为样品测试前稀释倍数。
1.2.5 细胞总RNA提取、逆转录及Realtime-PCR将RAW264.7细胞转入到6孔板中，每孔中的细胞个数为2×106个/mL，每孔2 mL，待细胞长至60%~70%后，分为3组处理，分别为对照组、LPS处理组及LPS加紫檀茋组，每组设置3个平行，继续培养24 h。收集细胞，采用Trizol试剂提取总RNA，通过测定吸光值OD260和OD280并计算其比值来判断RNA的纯度并测定其浓度，按照cDNA逆转录试剂盒将mRNA逆转录成cDNA；通过特异性引物进行Realtime-PCR扩增，18S作为内参，检测对应炎症因子的表达量，引物序列见表 1。此反应依照Faststart Essential DNA Green Master试剂盒进行，扩增程序:95 ℃，10 min；95 ℃，10 s；60 ℃，10 s；72 ℃，10 s；45个循环。
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表 1 引物序列 Tab.1 Primer sequences |
将RAW264.7细胞转入到6孔板中，每孔中的细胞个数为2×106个/mL，每孔2 mL，细胞培养48 h后，分为3组处理，分别为对照组、LPS处理组和LPS加紫檀茋组，每组设置3个平行，培养30 min后，PBS冲洗2遍，RIPA裂解液提取蛋白，收集细胞蛋白，定量，等量蛋白上样，进行SDS-PAGE电泳，半干转PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭1 h，一抗4 ℃过夜，PBST洗膜3次，HRP标记二抗30 min，PBST洗膜3次，ECL化学发光显色反应，用凝胶成像分析系统成像。
1.3 统计学处理实验数据采用Graph Pad Prism 5.0软件进行处理，所有数值以Mean ± SEM表示，组间比较采用方差分析和t检验，P＜0.05为差异显著。
2 结果 2.1 不同浓度LPS对RAW264.7细胞炎症因子表达的影响为确定LPS诱导炎症的合适浓度，分别检测了50、100和150 ng/mL的LPS刺激RAW264.7细胞对炎症因子表达量的影响。MCP-1、IL-6、IL-1β和TNF -α是免疫细胞分泌的一系列重要炎症因子。由图 1可知，3种浓度梯度的LPS在处理细胞24 h后，均能诱导RAW264.7细胞提高炎症因子 MCP-1、IL-6、IL-1β和TNF-α基因的表达量。在100 ng/mL的LPS刺激下，对炎症因子表达上调已经达到极显著的效果(P＜0.001)，细胞产生明显的炎症反应，且未见细胞损伤，因此后续实验选用100 ng/mL的LPS刺激细胞产生炎症。
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与空白组比较，** P < 0.01; ***P < 0.001 Compared with the blank group, ** P < 0.01; ***P < 0.001 图 1 不同浓度LPS诱导RAW264.7细胞对炎症因子基因表达的影响 Fig. 1 Effects of different concentration of LPS on gene expression of inflammatory cytokines in RAW264.7 cells |
为明确紫檀茋的无毒作用浓度，检测了不同浓度紫檀茋对RAW264.7细胞活力的影响。图 2结果显示，不同浓度的紫檀茋处理细胞24 h后，与空白组相比，低于10 μmol/L的紫檀茋处理对细胞存活率无明显作用，超过10 μmol/L浓度的紫檀茋使细胞存活率降低到80%左右，毒性作用明显(P＜0.001)。因此，最终确定使用的紫檀茋浓度为5 μmol/L。
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与空白组比较，*** P < 0.001 Compared with the blank group, ***P < 0.001 图 2 紫檀茋对RAW264.7细胞活力的影响 Fig. 2 Effects of Pte on cell viability in RAW264.7 cells |
由图 3可知，与空白组对比，100 ng/mL LPS刺激细胞后，极大提高了MCP-1、IL-6、IL-1β和TNF-α这4种炎症因子的mRNA表达水平，说明LPS刺激可以造成巨噬细胞炎症因子转录水平的显著上升，这与模型建立的结果一致。与LPS组相比，紫檀茋对上述炎症因子均有抑制作用，且效果显著(P < 0.001)。
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与control组比较，### P < 0.001；与LPS组比较，*** P < 0.001 Compared with the control group, ### P < 0.001; Compared with the blank group, ***P < 0.001 图 3 紫檀茋对LPS刺激的RAW264.7细胞 MCP-1、IL-6、IL-1β和TNF-α表达量的影响 Fig. 3 Effects of Pte on expression of MCP-1, IL-6, IL-1β and TNF-α in LPS-induced RAW 264.7 cells |
NO是一种重要的炎性介质，参与宿主的免疫防御和调节过程。由图 4可知，紫檀茋能显著抑制细胞NO的释放，经紫檀茋处理，培养基中的NO浓度恢复至空白对照水平(P=0.001)。iNOS作为NO生成的关键限速酶，其基因表达水平是调控NO释放的重要因素，通过检测iNOS mRNA水平的表达，发现LPS可显著上调iNOS表达，而紫檀茋能够显著降低LPS诱导的iNOS表达量(P＜0.001)。
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与control组比较，### P < 0.001；与LPS组比较，*** P < 0.001 Compared with the control group, ### P < 0.001; Compared with the blank group, ***P < 0.001 图 4 紫檀茋对LPS刺激的RAW264.7细胞NO释放量及iNOS基因表达的影响 Fig. 4 Effects of Pte on NO production and gene expression of iNOS in LPS-induced RAW 264.7 cells |
MAPK包括ERK、JNK和p38，是参与炎症相关信号通路的重要酶。因此，通过Western blot法检测了紫檀茋对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞中MAPK途径的影响。结果显示，紫檀茋对ERK和p38的磷酸化均有抑制作用，但对JNK没有抑制作用。另外，NF-κB在调节炎症因子中起重要作用。活化的NF-κB易位至细胞核以结合特异性DNA，进而调节各种炎性细胞因子的表达。因此，进一步检测了紫檀茋对LPS诱导的巨噬细胞中NF-κB p65磷酸化的影响，结果显示紫檀茋显著降低了p65的蛋白磷酸化水平。以上结果表明紫檀茋通过抑制MAPK和NF-κB途径抑制炎症因子基因的表达。
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与control组比较，### P < 0.001；与LPS组比较，*** P < 0.001 Compared with the control group, ### P < 0.001; Compared with the blank group, ***P < 0.001 图 5 紫檀茋对LPS刺激的RAW264.7细胞MAPK和NF-κB p65蛋白表达的影响 Fig. 5 Effects of Pte on protein expression of MAPK and NF-κB p65 in LPS-induced RAW264.7 cells |
紫檀茋是一种存在于蓝莓、树莓中的多酚物质。尽管其抗炎作用少有报道，其结构类似物白藜芦醇，则被公认为具有优良的抗炎效果[15-16]。鉴于其与白藜芦醇结构类似，推测紫檀茋很有可能具有抑制炎症的作用。探究了紫檀茋在LPS刺激的RAW264.7细胞中的抗炎作用，发现紫檀茋能够显著抑制促炎因子MCP-1，IL-6，IL-1β和TNF-α在mRNA水平的表达，并能通过抑制iNOS表达来抑制LPS诱导的NO的产生。此外，还发现紫檀茋可能是通过阻断MAPK和NF-κB通路来抑制炎症反应。
MCP-1已经被证实是负责招募巨噬细胞的主要趋化因子，广泛参与了类风湿关节炎、心血管疾病和动脉粥样硬化等多种炎性疾病的发生[17]。IL-6是目前发现在慢性炎症疾病中作用最突出的细胞因子。同样，IL-1β和TNF -α能够增强巨噬细胞的敏感性，结合相应的受体，然后继续作为刺激信号激活更多的巨噬细胞，促进炎症的发展[18-19]。上述炎症因子被广泛用于指示炎症反应强度。本研究通过检测RAW264.7巨噬细胞中上述炎症因子的基因表达，证实了紫檀茋显著降低了LPS诱导的炎症因子，可以抑制炎症发生，这与白藜芦醇的抗炎作用类似。彭洁等[20]通过培养外周血单个核细胞，结果发现白藜芦醇能够有效抑制促炎因子IL-1β、IL-6及MCP-1表达。ZONG等[21]发现白藜芦醇同样能够抑制LPS诱导的RAW264.7细胞 IL-1β和TNF-α的表达。此外，我们发现紫檀茋除了抑制MCP-1、IL-6、IL-1β和TNF-α 等炎症因子的表达，同时抑制了炎性介质NO的产生，具有多靶点抑制炎症反应的特性。NO由一氧化氮合酶(NOS)催化产生，高浓度NO有一定杀菌作用，但可作为促炎介质引起全身炎症反应，在炎症相关发病过程中起关键作用[22-23]。NOS有3种亚型结构，其中诱导型一氧化氮合酶被认为是巨噬细胞中NO合成的主要限速酶。本研究表明紫檀茋通过下调iNOS的表达起到抑制NO生成的效果，这与白藜芦醇的作用途径一致[24]。
MAPK家族主要包括3种信号通路的转导，分别为ERK、JNK和p38，这3条途径在炎症反应中起重要作用[25]。ZONG等[21]研究发现白藜芦醇能够通过抑制ERK、JNK和p38的蛋白磷酸化水平来下调炎症因子的表达。与白藜芦醇不同的是，本实验结果显示紫檀茋能够有效抑制ERK和p38的磷酸化水平，而对JNK无明显抑制作用。因此，紫檀茋的抗炎作用与ERK和p38通路相关，主要通过抑制ERK和p38的磷酸化水平来下调炎症因子的表达。这可能由于两种多酚结构的不同，苯环上的羟基被甲氧基所取代，从而导致作用的途径不同。NF-κB是调节参与炎症的各种基因转录的关键核转录因子。一般而言，NF-κB以异二聚体结合ⅠκB的形式位于细胞质中。当细胞受到刺激后，ⅠκB-α被磷酸化并迅速降解，促进NF-κB p65的激活和磷酸化。活化的NF-κB易位至细胞核以结合目标DNA并诱导其下游炎性细胞因子如MCP-1，IL-6，IL-1β和TNF-α的过度表达，并最终诱导炎症反应的发生[26-27]。因此，NF-κB p65的含量和形式的变化是NF-κB途径活化的重要标志。本实验进一步探究了紫檀茋对NF-κB p65蛋白表达的影响，结果显示紫檀茋能够显著降低NF-κB p65的蛋白磷酸化水平，这表明紫檀茋对炎症因子的抑制作用部分是通过对NF-κB p65的抑制而实现的。因此，紫檀茋还可通过阻断NF-κB途径来发挥抗炎作用。
4 结论总之，紫檀茋能够显著抑制多种炎症因子的mRNA表达以及炎性介质的释放，表现出显著的改善炎症效果。对其抗炎机制的分析提示，紫檀茋可能是通过阻断MAPK和NF-κB途径的激活来抑制炎症因子的转录和表达，从而发挥抗炎的功效。因此，紫檀茋作为一种天然的多酚化合物，表现出多靶点抑制炎症反应的特性，在开发新型有效的功能性食品方面将具有很大优势。
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