上海港地处长江东西运输通道与海上南北运输通道的交汇点，是我国对外开放，参与国际经济大循环的重要口岸。随着港口和海洋贸易的迅猛发展，大量远洋船舶通过压载水和船底附着生物将外来生物携带进入上海港口，成为海洋外来生物入侵的主要途径，给港口及周边海域带来了巨大的生态压力。

船舶装载压载水是为了使船体保持平衡，保证航行安全的一种有效措施^[1]。压载水往往在船舶装载货物时被排入海中，压载水含大量致病性病原菌，这些病原菌一旦流入新环境，将严重破环当地生态，对人类健康构成威胁^[2-5]。国际海事组织(International Maritime organization, IMO)指出，这些外来物种的入侵，是对全球海洋健康造成致命性威胁的元凶之一。如澳大利亚的毒性双鞭毒藻事件，1991年霍乱首次通过船舶压载水传入南美洲事件，欧洲的斑马贝经过压载水带到了北美洲五大湖事件等，给当地造成了极大的危害^[6]。因此开展上海口岸压载水携带的致病微生物的调查和研究工作，对于预防海洋物种入侵，防止致病菌的传播具有重要意义。

自2001年开始，我国先后在11个港口进行压载水携带外来生物的研究活动共15次，调查项目涵盖了微生物以及浮游生物等指标，但是这些调查对于各种微生物的具体物种没有展开详细研究。林纪灿对于珠海港的船舶压载水进行了致病性弧菌检测，发现压载水中致病弧菌检出率为86.20%，并分离到12种致病弧菌^[7]。王爱民对湛江口岸国际船舶压载水进行检测，未发现致病微生物，大肠菌群阳性率为8.6%^[8]。李俊成对秦皇岛区域国际船舶压载水进行检测，未检测到致病菌，大肠菌群阳性率为17.65%^[9]。

为了解上海港船舶压载水细菌总数、总大肠菌群、霍乱弧菌和肠球菌的流行病学情况，为探讨压载水卫生管理和卫生处理方法提供参考依据，我们对入出境上海口岸洋山港、崇明港、外高桥港的20艘船舶的压载水进行了致病微生物的分布调查和病原学研究，发现其中两艘船舶存在总大肠菌群，另外发现了三种致病单胞菌和一株致病性肠球菌。这些有害微生物的存在，提醒我们要进一步对压载水及其他可能的传播方式进行监督监控，建立上海港外来入侵生物监测技术体系，形成港口外来微生物业务化监测运行机制，提高地方海洋管理和监测部门履行海洋外来物种监测和防控的能力，为保障上海港海域的生态安全和疾病防控提供技术支撑。

1 材料与方法 1.1 材料

对来自不同国家和地区的20艘船舶的压载水中微生物(包括细菌总数、总大肠菌群和霍乱弧菌和肠球菌等)进行调查。

1.2 研究方法 1.2.1 样本采集

船舶在入境检疫时进行压载水采集，采样时根据压载水的水位采集1~3个点。

1.2.2 检验项目及方法

(1) 细菌总数：参照GB/T 5750.12—2006^[10]进行检测。

用灭菌的生理盐水依次按照1:10，1:10²，1:10³，1:10⁴等稀释待检水样，将待检水样及稀释液各取1 mL分别加入灭菌的营养琼脂平板中培养48 h，并进行计数。

(2) 总大肠菌群：参照GB/T 5750.12—2006^[10]进行检测。

通过乳糖发酵试验，如果所有乳糖蛋白胨培养管都不产气产酸，则可报告为总大肠菌群阴性，如有产酸产气者，则进行伊红美蓝琼脂平板的分离培养，并进行革兰氏染色、镜检和证实试验。

根据确认为总大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100 mL水样的总大肠菌群最可能值，5管法结果见表 1，稀释样品查表后所得结果应乘以稀释倍数，所有乳糖发酵管阴性时，可报告总大肠菌群未检出。

(3) 霍乱弧菌：参照SN/T1022—1010^[11]进行检测

取25 mL待检测水样，接种到碱性蛋白胨水增菌培养基，在37±1 ℃培养24 h，取该增菌液接种到碱性蛋白胨水增菌培养基上，41±1 ℃培养18±1 h。

将上述增菌后的培养物接种到TCBS琼脂和CHROM ID VIBRIO弧菌显色培养基平板以获得分离纯化的菌落，进而进行镜检，并将分离的菌落接种到营养琼脂平皿上过夜培养，挑选3~5个较大的单菌落，稀释到生理盐水中，通过梅里埃VITEK2全自动细菌鉴定仪鉴定。

(4) 肠球菌：参照SN/T2206.5—2009 ^[12]和BS EN ISO 7899—2:2000, BS 6068—4.4—2000 ^[13]进行检测。

在无菌条件下，对100 mL待检测液进行抽滤，抽滤的滤膜孔径为0.45 μm，将抽滤后的滤膜用无菌的镊子放入KF固体培养基的平皿中培养24 h后，在KF琼脂平板上形成暗红色至粉红色典型或可疑菌落进行观察及计数。取上述可疑菌落进行革兰氏染色，并通过VITEK2全自动细菌鉴定仪鉴定。

2 结果 2.1 细菌总数检测

对水样进行检测，1:10²的稀释度平皿进行计数比较合适，细菌总数经检测为10³~10⁴ cfu/mL之间，平均值为3.8×10³ cfu/mL。

2.2 总大肠菌群检测

对总大肠菌群的检测显示，其中有三条船共4份水样中检测到了总大肠菌群，查MPN表发现其分别为9.2、>16和5.1，其余样本的MPN值< 2.2，见表 2。

2.3 霍乱弧菌检测

对20艘船共33个水样进行检测，未发现霍乱弧菌的存在。在检测霍乱弧菌的过程中, 经过初筛发现了有两艘船压载水中的细菌能在碱性蛋白水中生长, 经过进一步鉴定发现分别是嗜水气单菌/豚鼠气单菌(Aeromonas hydrophila/caviae)和少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)。

2.4 肠球菌检测

经过筛查，22份样本检测到肠球菌疑似菌，进一步鉴定发现，只有一份样本为铅黄肠球菌，其他为非致病性球菌。这些菌分布在共15艘船的22个样本中，其菌落数目在3~86 cfu/100 mL，表 2，3。

3 讨论

本次调查的20艘国际航行船舶, 其中外籍船舶14艘, 中国籍船舶6艘。其压载水装自太平洋及大西洋地区。在调查的20艘船舶中，有三艘船舶(15%)的压载水中总大肠杆菌不符合国家标准GB/T 5750规定，与湛江口岸^[8]的8.6%和秦皇岛口岸^[9]的17.64%相比，处于中间水平。

细菌总数的测定平均值为3.8×10³ cfu/mL，远小于湛江口岸^[8]的16 444 cfu/mL。本次研究还发现大量球菌的菌群，以及一株致病性铅黄肠球菌，也不符合标准SN/T2206.5—2009和BS EN ISO 7899-2:2000。这些致病性微生物的存在都说明了压载水存在的风险。在检测霍乱弧菌的过程中, 发现并鉴定了两株其他的有害致病菌，其中一株是弧菌科的气单胞菌，可能是嗜水气单菌/豚鼠气单菌(Aeromonas hydrophila/caviae)，需要进一步进行鉴定。嗜水气单胞菌对鱼蛙等冷血动物和小鼠、豚鼠、家兔等温血动物均有致病性。常引起人霍乱样腹泻，有时还可引起创伤感染、脑膜炎、肺炎、尿路感染等^[14-15]。豚鼠气单胞菌(A. caviae)，还可引起人的感染发病，引起人类和动物的腹泻，在全世界许多国家都有发现，我国近年来相继也有不少报道^[16-17]。

另一株有害致病菌是少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)，是革兰阴性非发酵菌, 属鞘氨醇单胞菌属, 有12个种, 在很多临床标本如血液、脑脊液、腹水、尿液、泌尿生殖道分泌物、创面以及医院环境监测标本中可以分离到, 并且可以引起医院感染, 以发热、体温升高为主, 临床症状不典型^[18-20]。

对肠球菌的检测中发现大量能在KF培养基上生长的菌种，并且菌的颜色和形态也很像肠球菌，但是经过鉴定，只有一株是铅黄肠球菌(Enterococcus casseliflavus)。铅黄肠球菌可引起抵抗力低下宿主的多种机会感染。铅黄肠球菌引起的感染在临床上均有体温升高、皮疹及相应感染灶部位的表现。临床上不仅可引起尿路感染、皮肤软组织感染还可引起危及生命的腹腔感染、败血症、心内膜炎和脑膜炎等^[21-23]。

本次研究结果发现，压载水携带了致病菌的，往往不是单一的致病菌，而是多种致病菌共存。在进行膜过滤的过程以及水质分析的过程中也可发现这些水杂质较多，较混浊，这也为致病菌的存在提供了环境。而这些致病菌的存在大大增加了压载水排入沿海口岸后的传染病风险，一方面是增加了口岸居民感染的可能性，另一方面这些微生物很可能是外来物种，容易引起物种的侵袭，影响本地的生态学和造成生物污染等。因此，加强出入境压载水的管理，防止致病微生物的传播，应当引起当前口岸及相关部门的重视。