2018,
Vol. 27
2. 农业部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室, 上海 201306;
3. 江苏中洋集团股份有限公司, 江苏 海安 226000
河鲀鱼肉鲜嫩味美，因此被誉为“长江三鲜”之首[1]。与一般鱼类和肉类相比，河鲀鱼肉具有高蛋白、低脂肪的特点，并富含人体必需氨基酸、矿物质等[2]。但河鲀鱼大都含有河鲀毒素(tetrodotoxin, TTX)，毒素集中于卵巢、肝脏、肾脏、血液、眼睛、鱼鳃及皮肤中。含有TTX的生物分布广泛，在美国，欧洲[3]，以及我国东南沿海地区[4]都有分布。TTX分子量为319 u，分子式为C11H17O8N3；在海洋生物毒素中，河鲀毒素毒性最强[5]。TTX是一种神经毒素[6]，1 g河鲀毒素的毒性是1 g氰化物的1万倍，而且比较稳定，用盐腌、日晒、一般加热烧煮等方法都不易消除，严重妨碍了对河鲀鱼的加工应用[7]。长期以来，河鲀一直是我国食品卫生部门禁止鲜食的鱼类之一[4]。从2016年10月起，农业部国家食品药品监督管理总局关于有条件放开养殖红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)和养殖暗纹东方鲀(Takifugu obscurus)加工经营的通知农办渔[2016]53号，先行有条件地放开了养殖红鳍东方鲀和养殖暗纹东方鲀两个品种产品的加工经营，食用加工过的养殖河鲀肌肉，更有安全保障。但尽管有条件的解禁，河鲀鱼相比其他一些水产品，客观上仍存在风险。已有商家打着解禁的旗号在市场上堂而皇之地销售“活体河鲀鱼”[8]。广东省疾控中心通报，全省共接报河鲀鱼毒素中毒事件8起，合计51人中毒，其中死亡1人[9]。本文调查了广东野生河鲀鱼横纹东方鲀(Takifugu oblongus)各组织的毒性，并与养殖河鲀鱼毒性比较。该实验采用的实验室开发的免疫磁珠层析试纸条检测河鲀毒素，此方法简易、实用、快速，可为河鲀食用安全提供及时和可靠的检测，为食用河鲀鱼安全提供技术保障。
1 材料与方法 1.1 仪器与试剂样品:2016年3月31日，野生横纹东方鲀(来自广东，由江苏中洋集团股份有限公司提供)17尾(其中雌性10尾，雄性7尾)；养殖暗纹东方鲀和菊黄东方鲀各3尾，购自江苏中洋集团。在4 ℃条件下，立即送到实验室解剖检样取出完整的内脏组织，分别标签注明并放入－40 ℃冰箱中。
主要仪器与试剂:乙酸(AR)、氢氧化钠(AR)等试剂购自国药集团化学试剂有限公司；Tween-20、牛血清蛋白(BSA)，购自上海生工生物制剂有限公司。
Millipore超滤离心管购自上海天承生物技术有限公司；TTX(HPLC级)标准品购自北京盈则纳新化学研究院(>99%)；还有TDC-40B台式离心机，电子天平，移液器等其他常规设备。TTX特异性抗体由本实验室自己制备(特异性抗体杂交瘤细胞产生)；样品垫，结合垫，CN140膜，吸水垫购自上海捷宁生物科技有限公司。磁珠购自上海奥润微纳新材料科技有限公司。雄性昆明小鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。
1.2 试验方法 1.2.1 样品制备参考本实验室之前的样品前处理方法[10]，称取绞碎的组织样品2 g加入5 mL 2%乙酸水溶液，煮沸10 min，冷却后收集上清，然后在沉淀中继续加入3 mL 2%乙酸水溶液再次煮沸3 min，冷却后收集上清，调pH至7~8并定容至10 mL，进行超滤处理，样品待测。超滤后收集滤液，用实验室自己开发的免疫磁珠层析试纸条进行定性检测。
1.2.2 试纸条制备参考本实验室之前的免疫层析试纸条制备方法[11-12]，免疫层析试纸条由样品垫，结合垫，NC膜，吸水垫组成。NC膜上面划C线，质控线，为羊抗鼠抗体；T线，检测线，为TTX-BSA抗原，TTX-BSA由TTX和BSA偶联得到[13]。
TTX特异性抗体由实验室自己培养的TTX特异性杂交瘤细胞产生并经过抗体纯化得到[14]，纯化后的抗体和磁珠偶联后得到实验所需的免疫磁珠[11]，层析液由磷酸缓冲液和Tween-20、BSA混合而成。
在检测时按照样品:磁珠:层析液为105:1:15的比例混合，滴加在试纸条上，加样后10 min读取结果。
1.2.3 试纸条的定性结果判定试纸条是基于竞争ELISA方法原理制备的。T线是TTX抗原，C线是二抗，当样本中没有TTX时，免疫磁珠就会与T线抗原结合，显示T线，C线可以捕捉到少量没被T线捕捉到的免疫磁珠；样品中有TTX时，免疫磁珠会与样品中TTX结合，在T线就不会有免疫磁珠被捕捉，从而只有C线。结果如下：A.阴性结果：质控区(C)和检测区(T)均出现条带(T条带颜色更深)或检测区(T)出现条带，判定为阴性；B.阳性结果：仅质控区(C)有一条带出现或均出现条带(C条带颜色更深)，检测区(T)无红色条带出现；C.检测结果无效：质控区(C)没有条带出现，表明此检测卡已经失效。
1.2.4 小鼠生物法按照出入境检验检疫行业标准《出口河鲀鱼中河鲀毒素检测方法》SN/T 1569.2—2013中相应的方法检测[15]，对每只试验小鼠腹腔注射1 mL提取液，并参照该标准中结果处理方法进行数据分析。
2 结果与讨论 2.1 免疫磁珠层析试纸条检测结果图 1为野生横纹东方鲀各个组织样本图片，分别为完整野生横纹东方鲀、其肝脏、精巢和卵巢。
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图 1 野生横纹东方鲀各组织样本
Fig. 1 The biological tissue sample of Takifugu oblongus
(a)横纹东方鲀; (b)肝脏; (c)精巢; (d)卵巢( a)Takifugu oblongus; (b)Liver; (c) Testicle; (d)Ovary |
免疫试纸条定性检测野生横纹东方鲀各组织样本检测结果如图 2所示。每个样品都用3个试纸条检测作为平行样本对照。
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图 2 野生横纹东方鲀组织样本定性检测图
Fig. 2 The qualitative analysis results of tissue samples in wild Takifugu oblongus
1.阴性对照；2.肌肉(雌)；3.精巢；4.卵巢(稀释100倍)；5.肝脏(雄稀释100倍)；6.卵巢(稀释10倍)；7.肝脏(雄稀释10倍)；8.肝脏(雄)
1. Negative sample; 2. muscle(female); 3. testicle; 4. ovary(diluted 100 times); 5. liver(diluted 100 times); 6. ovary(diluted 10 times); 7. liver(male diluted 10 times); 8. liver(male) |
图 2中标号1为阴性对照，阴性对照为PBS缓冲液，此种情况表示无毒；其他标号为组织样本抽选。抽选出8个具有代表性的组织样本，由图可见，T线颜色逐渐变浅，C线颜色逐渐增加，标号1，2，3样本T线颜色很深，C线颜色很浅，为无毒；标号4，5，6，7样本T线颜色和C线颜色相差无几，弱毒；标号8样本T线颜色很浅，C线颜色很深，为强毒；其他组织样本的试纸条定性检测结果和图 2中的相似，由于篇幅限制，不再一一列举。
图 3包含了17尾横纹东方鲀组织样本全部检测结果，肉眼观察定性结果可知，17尾野生横纹东方鲀肌肉和精巢均处于无毒或弱毒水平，卵巢和肝脏都处于强毒水平，根据试纸条结果进行初筛，选出几个具有代表性的样本进行小鼠生物法检测。
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图 3 17条野生横纹东方鲀组织样本定性检测图
Fig. 3 The qualitative analysis results of 17 tissue samples in wild Takifugu oblongus
标号1-17为不同野生横纹东方鲀个体。图片分为上中下3部分，其中上为肌肉样本，中为精巢或卵巢样本，下为肝脏样本，其中1，4，5，8，9，10号为雄性样本，其他为雌性样本 Sequence 1-17 for different individual Takifugu oblongus. Image is divided into 3 parts, the upper part of image for muscle samples, the middle part of image for the gonads samples, the lower part of image for the liver samples, 1, 4, 5, 8, 9, 10 for the males, anothers for the females |
由于小鼠生物法是检测TTX的标准方法，具有直观、快速、症状典型、易操作等特点，被国际上广泛采用。因此根据试纸条结果对样品进行初筛，选取几个具有代表性的样本用小鼠生物法进行检测，无毒或弱毒，强毒样本都包括在内；并且有雌性、雄性横纹东方鲀样本。共选取7尾野生横纹东方鲀总计15个样本：其中3尾横纹东方鲀(雄性1尾、雌性2尾)提供了3个肌肉样本，1个精巢样本，2个卵巢样本和3个肝脏样本；另外两条雄性横纹东方鲀提供精巢样本2个；另外两尾雌性横纹东方鲀仅提供卵巢2个和肝脏样本2个。另外，又选取养殖菊黄东方鲀雄性、雌性各3尾，暗纹东方鲀雄性、雌性各3尾，分别提供肌肉，卵巢，精巢和肝脏总计12个样本。
根据《出口河鲀鱼中河鲀毒素检测方法》SN/T 1569.2-2013中方法进行小鼠实验，以TTX标准品注射剂量为自变量(X)，小鼠死亡时间倒数为因变量(Y)绘图，获得了TTX注射剂量与小鼠死亡时间倒数的线性关系(图 4)。
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图 4 TTX剂量-昆明系小鼠死亡时间倒数关系曲线
Fig. 4 Curves of TTX dosage against mean death time of Kunming mice
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根据标准曲线公式和注射组织样本后小鼠的死亡时间，计算得出横纹东方鲀各组织和养殖河鲀鱼各组织样本的TTX含量，见表 1(统计学数据显著性检验P值＜0.05)。
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表 1 野生横纹东方鲀和养殖河鲀鱼各组织毒素含量 Tab.1 The toxicity of tissues in Takifugu oblongus and cultured pufferfish |
从表 1可以看出，此次检测的所有养殖河鲀鱼(暗纹东方鲀、菊黄东方鲀)样本TTX含量(序号16-序号27)都处于无毒水平(此结果根据标准中规定小鼠死亡时间超过30min判定为无毒得出)。
按日本谷氏对河鲀毒性强弱的分类标准，每克组织中含有小于10个鼠单位(MU)的可认为无毒，在10 ~ 100 MU的为弱毒，在100 ~ 1 000 MU的为强毒，在1 000 MU以上的为剧毒。对人而言，含毒在10个鼠单位以内，即2.2 μg TTX/g鱼组织，不能致人死亡。这也是一般认为的可食用的河鲀鱼的安全标准[16]。
根据图 3试纸条定性检测结果，肌肉和精巢处于无毒、弱毒水平，肝脏处于强毒剧毒水平。由表 1可见，野生横纹东方鲀肌肉和精巢TTX含量在0~40 μg/g组织，为无毒或者弱毒；卵巢TTX含量在25 ~300 μg/g组织范围内，为弱毒或者强毒；肝脏TTX含量在90~2 000 μg/g组织范围内，为强毒或剧毒。由此可见，小鼠生物法和试纸条检测结果相吻合。本研究所用野生河鲀鱼横纹东方鲀采自冬季，非产卵期，故此卵巢毒素含量偏低，处于弱毒水平，但3号野生横纹东方鲀的卵巢组织(序号9)处于强毒水平，肝脏(序号13)强毒水平，较其他肝脏剧毒水平偏低，可能由于此河鲀鱼处于排卵期，卵巢毒素含量高来保护后代，属于个体差异[17]。许多文献报道都显示野生河鲀鱼有毒。ITOI报道野生星点东方鲀毒素含量随季节变化而不同，产卵期显著高于非产卵期；雌性卵巢、皮肤和雄性肝脏、皮肤在任何时期都有毒素[18]。近5年来，在全世界范围内食用野生河鲀鱼引起了430例中毒和52例死亡事件[19]。KOSKER等报道，野生河鲀鱼体内TTX含量与季节和性别都相关，肝脏和性腺毒素含量较高，肌肉也有毒性，食用有危险[20]。日本海域的野生虫纹东方鲀皮肤TTX含量很高[21]。KOSKER调查了地中海不同季节河鲀不同部位的TTX含量，发现无论在哪个季节，都大于2 μg/g，与表 1检测数据吻合[20]。KIRIAKE等报道成年河鲀毒素主要聚集在肝脏，幼年河鲀会把毒素由肝脏转移到皮肤[22]；检测的序号12肝脏组织和序号2肌肉组织来源于2号的野生横纹东方鲀，肝脏和肌肉毒素含量都处于弱毒水平，因此推测此河鲀鱼可能处于幼年，也有可能由于死亡时间久，导致了毒素的弥散和转移。
小鼠生物法检测的15个野生横纹东方鲀组织样本是从免疫磁珠层析试纸条检测结果中挑出的含量低、中、高的野生横纹东方鲀组织样本，并用河鲀毒素经典检测方法国标小鼠生物法检测，两种方法检测结果吻合，说明免疫磁珠层析试纸条检测效果比较好，而且方便快捷，相对更适应于现场检测。
3 结论本研究发现，养殖河鲀鱼的肌肉处于无毒水平，但我们调查的野生横纹东方鲀的河鲀鱼肌肉有可能由于死亡之后毒素扩散有毒性，且内脏组织毒素含量远高于养殖河鲀鱼，提醒广大人民群众野生河鲀鱼味道虽美，但是食用需谨慎。而且从2016年10月起，农业部国家食品药品监督管理总局关于有条件放开养殖红鳍东方鲀和养殖暗纹东方鲀加工经营的通知农办渔[2016]53号先行有条件地放开养殖红鳍东方鲀和养殖暗纹东方鲀两个品种产品的加工经营，因此建议食用加工过的养殖河鲀肌肉，更有安全保障。本研究采用的实验室开发的免疫磁珠层析试纸条检测河鲀毒素，此方法简易、实用、快速，可为河鲀食用安全提供及时和可靠的检测，为食用河鲀鱼安全提供了技术保障。
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2. Laboratory of Quality & Safety Risk Assessment for Aquatic Products on Storage and Preservation, Ministry ofAgriculture, Shanghai 201306, China;
3. Jiangsu Zhongyang Group Co., Ltd, Haian 226000, Jiangsu, China