2018,
Vol. 27
2. 海南大学 热带作物种质资源保护与开发利用教育部重点实验室, 海南 海口 570228
胶网藻(Dictyosphaerium sp.)也称胶球藻或网球藻，淡水绿藻，属于绿藻门(Chlorophyta)、绿藻纲(Chlorophyceae)、绿球藻目(Chlorococcales)、胶网藻科(Dictyosphaeriaceae)、胶网藻属(Dictyosphaerium)。细胞呈球形、卵形或肾形[1]。胶网藻具有极端环境适应能力强、生长速度快、易培养、油脂含量高等优点[2-3]。近年来，对该藻的应用研究主要集中在环境污染处理、污水处理和高密度培养等方面[4-5]，未有研究对其营养成分和抗氧化活性进行分析。有研究表明[6-7]，微藻含有大量的不饱和脂肪酸(PUFAs)，其中二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)都是人体必需脂肪酸，在增强免疫力、抗衰老和治疗多种疾病方面起着重要的作用[8-9]，具有丰富的营养价值。
本研究以胶网藻(Dictyosphaerium sp. 1A10)为研究对象，对其一般营养成分、维生素、微量元素、氨基酸和脂肪酸等营养成分和抗氧化活性进行分析，为其在食品及饲料方面的开发利用提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 材料与仪器 1.1.1 材料与试剂胶网藻(Dictyosphaerium sp. 1A10)藻种分离自海南热带淡水区域，经管道式生物反应器培养，经壳聚糖絮凝采收后8 000 r/min离心，冷冻干燥得藻粉，于-20 ℃保存。所需试剂：NaOH、浓硫酸、磺基水杨酸、buffer1缓冲液、AQC衍生剂、浓盐酸、三乙胺、KH2PO4、浓硝酸、过氧化氢、磷酸盐缓冲液、乙腈、甲醇、正己烷和色谱纯等。所有试剂均采购自国药集团。
1.1.2 仪器设备仪器设备包括TU-1810紫外-可见分光光度计(北京普析有限责任公司)，TDL-5型离心机(常州中捷有限公司)，X0-5200DTD型超声清洗仪(南京先欧有限公司)，HP6890型气相色谱仪(美国惠普公司)，Waters 2695型液相色谱仪(美国Waters公司)，X7型电感耦合等离子体质谱仪(美国热电公司)和A320型电子顺磁共振波谱仪(德国布鲁克公司)。
1.2 实验方法 1.2.1 一般营养成分测定蛋白质测定：双缩脲法[10]；总糖测定：硫酸-蒽酮比色法[10]；油脂测定：氯仿-甲醇重量法[11]；灰分的测定：参照GB 5009.4—2010《食品安全国家标准食品中灰分的测定》；粗纤维测定：参照GB/T 5009.10—2003《植物类食品粗纤维测定法》；能量：蛋白质供能4 kcal/g、多糖供能4 kcal/g、油脂供能9 kcal/g。
1.2.2 脂肪酸分析取藻粉0.5 g，加入0.5 mol/L的NaOH-甲醇溶液5 mL，震荡混合10 min后加入1%硫酸-甲醇溶液8 mL，震荡混合10 min，再依次加入2 mL水和3 mL正己烷，离心收集上层溶液，重复萃取3~5次，合并上层溶液，待溶液挥发浓缩至1 mL左右用0.22 μm微孔滤膜过滤，置于气相色谱样品管中，封口待测。
用HP6890型气相色谱仪(美国惠普公司)测定脂肪酸种类及其含量。色谱条件：检测器，氢火焰离子化检测器(FID)，色谱柱：石英毛细管柱HP-FFAP(30 m×0.25 mm, 0.25 m)，程序升温：从160 ℃开始，以6 ℃/min升到250 ℃，保持5 min；载气：He，柱流量：1.0 mL/min，进样口温度：250 ℃，分流比：50:1。质谱条件：EI源，电离电压：70 eV，离子源温度：230 ℃，扫描范围：10~500 amu，进样量：1.0 μL。检索质谱图库，对藻油中脂肪酸进行定性，定量分析采用对各组分峰面积积分，计算出脂肪酸各组分占脂肪酸总量的百分比[12-14]。
1.2.3 氨基酸分析 1.2.3.1 样品处理与测定称取2 g样品于离心管中，加入10%磺基水杨酸20 mL，用超声波细胞破碎仪低温超声10次，混合均匀，于4 ℃下放置15~17 h，5 000 r/min离心10 min，滤液用1 mol/L的NaOH调整pH至6.0，加入超纯水定容至50 mL，取2 mL滤液用0.22 μm微孔滤膜过滤，置于样品管中备用。
测定条件参照赵改名等[15]的方法并加以改进：AccQ·Tag柱(Nava-Pak, 3.9 mm×150 mm, 4 μm)，柱温37 ℃；进样体积10 μL；Waters515双泵梯度洗脱，洗脱液A为AccQ·Tag洗脱液用超纯水稀释11倍而成，洗脱液B为60%色谱纯乙腈；洗脱速度为1.0 mL/min，洗脱时间50 min。梯度洗脱按如下程序进行：洗脱液B初始质量浓度为0，在0.5 min内升至1.0%，接着在16.5 min内升至7.0%，然后4 min升至10.0%，9 min再升至33.0%，然后1 min升至100.0%，保持3 min，最后于1 min内降到0，并维持12 min。
1.2.3.2 营养评价方法胶网藻1A10的营养评价根据1973年世界卫生组织/联合国粮农组织(WHO/FAO)提出的人体必需氨基酸模式[16-17]计算样品中的下列指标[18]：
(1) 必需氨基酸(essential amino acid, EAA)占总氨基酸的质量分数
(1)
式中：A0为样品中必需氨基酸含量；A为样品中总氨基酸含量。
(2) 氨基酸比值(ratio of amino acid, RAA)
(2)
式中：B0为待评价蛋白质某必需氨基酸含量; B为WHO/FAO模式中相应氨基酸含量。
式中：待评价蛋白质中某必需氨基酸含量与FAO/WHO模式中相应必需氨基酸含量单位均为mg/g pro。胱氨酸和酪氨酸由蛋氨酸和苯丙氨酸分别转变而成，因此分别将苯丙氨酸和酪氨酸，蛋氨酸和胱氨酸合并计算[18]。
(3) 氨基酸比值系数(ratio coefficient of amino acid, RC)
(3)
式中：RC>1表明该种必需氨基酸相对过剩，RC=1表明其组成比例与FAO/WHO模式中相应必需氨基酸一致，RC < 1表明该种必需氨基酸相对不足，RC最小者为第一限制氨基酸[19]。
(4) 比值系数分(score of ratio coefficient of amino acid, SRCAA)
式中：SRCAA=100时，表明胶网藻1A10中必需氨基酸的组成比例与FAO/WHO模式一致，SRCAA越接近100，表明营养价值越高，SRCAA越小，则营养价值越低[20-21]。
1.2.4 维生素的测定水溶性维生素(VB1, VB2, VB3, VB6, VB12)：准确称取2 g藻粉于研钵中研磨破碎细胞壁，待研磨充分，将藻粉完全转入离心管中，加入15 mL 0.1mol/L的盐酸，用超声清洗机超声15 min，5 000 r/min离心10 min，取上清液2 mL用0.22 μm微孔滤膜过滤，置于西林瓶中备用。
脂溶性维生素(VA, VE)：参照GB/T 5009.82—2003《食品中维生素A和维生素E的测定》处理藻粉。
测定条件为VB1：Waters X Bridge(4.6 mm×250 mm, 5 μm)反相色谱柱；流动相为0.05 mol/L KH2PO4:乙腈(含0.2%的三乙胺，pH=6)=97:3；检测波长为254 nm；流速为1.5 mL/min。
VB2：Waters X Bridge(4.6 mm×250 mm, 5 μm)反相色谱柱；流动相A为0.05 mol/L KH2PO4(pH=6):乙腈(含0.2%的三乙胺，pH=6)＝9:1，流动相B为：甲醇，A:B=75:25，柱温30 ℃，检测波长270 nm；流速1.0 mL/min。
VB3, VB6：Ultimate AQ(4.6 mm×250 mm, 5 μm)反相色谱柱；流动相为0.05mol/L KH2PO4:甲醇=9:1；检测波长为266 nm；流速为1.0 mL/min。
VB12：参照GB/T 5009.217—2008。
VA, VE：Waters X Bridge(4.6 mm×250 mm, 5 μm)反相色谱柱；流动相为甲醇:水=97:3；检测波长为325 nm；流速为1.0 mL/min。
VC：参照GB/T5009.86—2003，采用2，4－二硝基苯肼比色法测定。
1.2.5 微量元素及重金属测定准确称取0.2 g干燥藻粉于聚四氟乙烯坩埚中，加入5 mL硝酸和2 mL过氧化氢，加盖后于电热板上120 ℃加热。2 h后，开盖，将温度升高至160 ℃继续加热，经常摇动坩埚。当坩埚内的液体澄清时，取下坩埚，待其冷却后，用超纯水冲洗坩埚盖和内壁，液体转移至25 mL容量瓶，定容，取2 mL用0.22 μm微孔滤膜过滤，置于样品管待测。
采用电感耦合等离子质谱(ICP-MS)的方法，对胶网藻1A10中Cu、Li、Mg、Mn、Zn、Ca等30种微量元素进行定量分析。工作参数见表 1。
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表 1 ICP-MS工作参数 Tab.1 ICP-MS operating parameters |
准确称取0.4 g干燥藻粉于匀浆管中，加入4倍体积的磷酸盐缓冲液，冰水浴条件下用超声波细胞破碎仪低温超声10次，低温低速离心机4 000 r/min离心10 min，取上清液待测。
测量方法参照周丽芳等[22]的方法并加以改进，量取样品50 μL，加入40 μL 0.2 mmol/L FeSO4水溶液、40 μL的双蒸水和40 μL 0.1 mol/L DMPO水溶液，混合均匀后加入40 μL 0.1% H2O2，混合后立即取样，用微量注射器取上清液注入Teflon毛细管中，插入顺磁石英样品管底部，将样品管插入谐振腔中心位置进行EPR检测，整个过程控制在3 min内完成。
实验参数为中心磁场：3 510 G；扫场宽度：100 G；调制频率：100 kHz；调制幅度：1.0 G；放大倍数：200e+004；扫描次数：1；微波功率：2.017 mW；时间常数：600 ms；扫场时间：41.943 s。
羟基自由基清除率的计算公式[20]如下：
式中：H0为空白对照样最高峰的峰高；H为样品最高峰的峰高。
2 结果与讨论 2.1 胶网藻的一般营养成分及评价胶网藻的主要营养成分(以每100 g可食部计算)结果见表 2，同时将几种常见食物的相应营养成分进行比较。由表 2可知，胶网藻的能量为371 kcal，低于黄豆(389.00 kcal)的能量，但比其他常见食物的能量高。胶网藻的多糖含量为19.15%，高于螺旋藻(18.20%)、牛肉(3.00%)和鸡蛋(0.00%)的多糖含量，但比海带(61.20%)、裙带菜(40.60%)、粳米(78.10%)和黄豆(37.30%)的多糖含量低。陈玮[23]等研究了微藻多糖生物活性，其中包括抗氧化、抗衰老和抗病毒活性等，因此胶网藻可作为潜在的多糖微藻资源。胶网藻的油脂含量为24.56%，在列出的常见食物中属于最高。此外，胶网藻的灰分含量为12.43%，除低于海带(20.0%)和裙带菜(35.4%)的灰分含量外，高于其他的常见食物的灰分含量，较高的灰分含量说明胶网藻能够吸附水体中的矿物元素而富集于藻体内，因此胶网藻中含有丰富的矿物元素，是很好的矿物源。同时，胶网藻的粗纤维含量为12.31%，在几种常见食物中最高，其可溶性纤维有利于降低动物体内胆固醇水平，所以胶网藻可以作为膳食纤维来源。并且，胶网藻蛋白质含量为18.55%，低于螺旋藻(64.7%)和黄豆(33.1%)的蛋白质含量，高于其他常见食物的蛋白质含量，说明胶网藻可作为食品或饲料的蛋白质来源。
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表 2 胶网藻1A10与常见食物一般营养成分含量 Tab.2 Nutrition components in Dictyosphaerium sp. 1A10 and the common food |
表 3是胶网藻与常见食物的脂肪酸组成。结果显示，胶网藻和其他常见食物相比，未检测出C12:0(月桂酸)、C14:0(豆蔻酸)和C15:0(十五酸)。但是其含有的C20:0(花生酸)和C20:1(n-9)(鳕油酸)是其他常见食物中没有的，含量分别为1.3%和3.2%。由表 3可以看出，胶网藻的C16:0(软脂酸)含量相对不足，除高于鸡蛋中C16:0(软脂酸)的含量4.3%外，低于其他常见食物；胶网藻的C18:2(n-6)(亚油酸)的含量为15.3%，除低于粳米中C18:2(n-6)(亚油酸)的含量39.6%外，高于其他常见食物；C18:3(n-6)(亚麻酸)的含量为8.5%，除螺旋藻中有C18:3(n-6)(亚麻酸)，其含量为26.9%，其他食物中均不含C18:3(n-6)(亚麻酸)，亚油酸和亚麻酸是生命代谢的必需脂肪酸，是动物体内高度不饱和脂肪酸(EPA和DHA等)的合成前体[25]，胶网藻PUFA的含量为26.5%，远低于螺旋藻中PUFA的含量41.6%和粳米中PUFA的含量39.6%，但高于其他常见食物。由此可以看出胶网藻作为人体脂肪酸的食物来源相对不足。
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表 3 胶网藻1A10与常见食物脂肪酸组成 Tab.3 The fatty acid compositions of Dictyosphaerium sp. 1A10 and the common food |
使用高效液相对样品溶液进行测定，胶网藻的氨基酸组成及含量如表 4所示。从表 4中可以看出，胶网藻中共检测出18种氨基酸，其中包括8种必需氨基酸和2种鲜味氨基酸。由表 4可知，胶网藻氨基酸总量为10.16%，其中必需氨基酸总量为3.2%，鲜味氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)总量为1.01%。
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表 4 胶网藻1A10的氨基酸组成及含量 Tab.4 Composition and content of amino acids of Dictyosphaerium sp. 1A10 |
胶网藻与常见食物中必需氨基酸的EAA值比较结果及WHO/FAO模式谱EAA值见表 5。胶网藻中苏氨酸(Thr)、缬氨酸(Val)、蛋氨酸(Met)、异亮氨酸(Ile)、赖氨酸(Lys)和色氨酸(Trp)的EAA值均高于WHO/FAO模式谱对应必需氨基酸的EAA值，分别为4.4、5.4、4.1、4.4、5.8和1.1，亮氨酸(Leu)和苯丙氨酸(Phe)的EAA值稍低于WHO/FAO模式谱对应必需氨基酸EAA值，分别为6.4和5.7。
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表 5 胶网藻1A10与常见食物中必需氨基酸的EAA值 Tab.5 The EAA values of essential amino acids of Dictyosphaerium sp. 1A10 and the common food |
胶网藻与常见食物中必需氨基酸的RAA、RC和SRC值比较结果见表 6。由RC值可以看出，胶网藻中必需氨基酸亮氨酸(Leu)和苯丙氨酸(Phe)相对不足，分别为0.85和0.89。其中亮氨酸(Leu)为第一限制氨基酸。苏氨酸(Thr)、缬氨酸(Val)、蛋氨酸(Met)、异亮氨酸(Ile)、赖氨酸(Lys)和色氨酸(Trp)均相对较高并且和WHO/FAO模式谱接近，分别为1.03、1.01、1.09、1.03、1.08和1.03。由表 6中SRC值可以看出，胶网藻中必需氨基酸的SRC值为98.01，高于海带中必需氨基酸的SRC值94.09和粳米中必需氨基酸的SRC值96.04，表明胶网藻含有较高的为动物所需的游离氨基酸。
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表 6 胶网藻1A10与常见食物中必需氨基酸的RAA、RC和SRC值 Tab.6 Values of RAA, RC and SRC of essential amino acids of Dictyosphaerium sp. 1A10 and the common food |
维生素是人和动物为维持正常的生理功能而必须从食物中获得的一类微量有机物质，在动物体生长、代谢、发育过程中发挥着重要的作用。由表 7可以看出，胶网藻中VB1、VB3、VB6、VA和VE的含量较高，分别为2.15 mg/100 g、6.25 mg/100 g、1.31 mg/100 g、2.37 mg/100 g和5.28 mg/100 g。其中VB3的含量最高，但低于螺旋藻(14.60 mg/100 g)、裙带菜(8.01 mg/100 g)和牛肉(6.3 mg/100 g)。VB1的含量除低于螺旋藻(3.10 mg/100 g)外，均高于其他常见食物，VB1是动物体内能量代谢，特别是糖代谢所必需的。VB6的含量均高于其他常见食物，在蛋白质代谢中起重要作用。VA的含量低于螺旋藻(6.91 mg/100 g)和裙带菜(53.63 mg/100 g)。VE的含量低于螺旋藻(10.01 mg/100 g)、黄豆(18.91 mg/100 g)和鸡蛋(5.29 mg/100 g)，但高于海带(1.85 mg/100 g)、裙带菜(3.35 mg/100 g)、粳米(1.01 mg/100 g)和牛肉(0.35 mg/100 g)，VE有促进生殖等作用[26]。胶网藻中VB2和VB12的含量比较低，分别为0.74 mg/100g和0.02 mg/100 g，其中VB2的含量高于海带(0.15 mg/100 g)、粳米(0.08 mg/100 g)、黄豆(0.24 mg/100 g)、牛肉(0.13 mg/100 g)和鸡蛋(0.32 mg/100 g)；VB12的含量低于其他常见食物。由此可见，胶网藻维生素种类较为齐全，且含量丰富，是一种具有潜力的维生素来源。
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表 7 胶网藻1A10与常见食物中维生素含量 Tab.7 Vitamin content of Dictyosphaerium sp. 1A10 and the common food (mg/100g) |
矿物质元素是构成机体组织的重要成份，具有维持机体的酸碱平衡及组织细胞渗透压等作用。由表 8可以看出，从胶网藻中共检测出30种矿物质元素，其中镁、钙、铁、钾含量较为丰富，分别为3 517.26 mg/kg、813.27 mg/kg、301.78 mg/kg和9 426.87 mg/kg。重金属铅、汞、砷、镉的含量，分别为0.27 mg/kg、0.01 mg/kg、0.02 mg/kg和0.15 mg/kg，均低于国家食品卫生标准GB 2762—2012《食品安全国家标准食品中污染物限量》(限量标准分别为1.0 mg/kg、0.5 mg/kg、0.5 mg/kg和0.5 mg/kg)。由此表明胶网藻富含多种矿物质元素，可以为动物体提供充足的微量元素。
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表 8 胶网藻1A10矿物质元素种类及含量 Tab.8 Contents of mineral element in Dictyosphaerium sp. 1A10 |
羟基自由基(·OH)是一种重要的活性氧，过量的羟基自由基具有极强的氧化作用，破坏机体内平衡。图 1中，a表示空白对照样的EPR谱图，得a图最高峰的峰高H0为840 655，b图最高峰的峰高H为314 221，b表示胶网藻对·OH的清除作用的EPR谱图，根据羟基自由基清除率的计算公式得到自由基清除率为62.62%。可见胶网藻对羟基自由基有一定的清除作用。
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图 1 胶网藻1A10对羟基自由基清除作用的EPR谱图
Fig. 1 EPR spectra of scavenging action of Dictyosphaerium sp. 1A10 on hydroxyl radicals
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胶网藻中含有丰富的营养成分，多糖、油脂、灰分、粗纤维和蛋白质分别占藻粉干重的19.15%、24.56%、12.43%、12.31%和18.55%，能量为371 kcal。除制备生物柴油外，可作为动物体营养物质的来源。胶网藻中含有多种脂肪酸，其中含有动物体必需脂肪酸C18:2(n-6)(亚油酸)和C18:3(n-6)(亚麻酸)，含量分别为15.3%和8.5%，可作为动物体多不饱和脂肪酸的来源；胶网藻含有18种氨基酸，包括8种必需氨基酸和2种鲜味氨基酸，其中必需氨基酸的SRC值为96.04，表明具有较多的游离氨基酸。胶网藻维生素种类较为齐全，且含量丰富，尤其VB1、VB3、VB6、VA和VE的含量较高，可以加工成食品或饲料，补充维生素缺乏而引起的不适。胶网藻富含多种矿物质元素，其中镁、钙、铁、钾含量较为丰富，可作为动物体必需微量元素的来源，且重金属铅、汞、镉的含量均低于国家标准。胶网藻对羟基自由基有较强的清除作用，清除率达62.62%。由此，胶网藻具有较高的营养价值，可作为潜在的食品或饲料开发，替代玉米、大豆以及高粱等传统作物，减轻土地压力，但作为动物体脂肪酸的食物来源相对不足。
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