2017,
Vol. 26
2. 河南师范大学 水产学院, 河南 新乡 453007
固醇调节元件结合蛋白(Sterol regulatory element binding protein,SREBP)是脊椎动物调节脂代谢的一类膜结合核转录因子，目前在哺乳动物中已发现3个成员：SREBP-1a、 SREBP-1c和SREBP-2，其中SREBP-1a和 SREBP-1c 由同一个基因SREBP-1的不同启动子转录生成[1]。SREBP-1主要激活与脂肪酸生成有关的基因，如脂肪酸合成酶基因(Fatty acid synthase,FASN),硬脂酰辅酶A脱氢酶基因(Stearoyl-CoA desaturase ,SCD),以及乙酰辅酶A羧化酶基因1(Acetyl-CoA carboxylase 1,ACC1)等，而SREBP-2主要作用于胆固醇调节基因，如3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因(HMG-CoA reducase,HMGCR)、低密度脂蛋白受体基因(Low-density lipoproteinreceptor ,LDLR)等[2]。miRNA-33是参与维持机体脂质稳态的一种小分子核糖核酸，在人类发现有miRNA-33a和miRNA-33b两个亚型，其编码序列分别定位于SREBP-2和SREBP-1基因的内含子上；而在小鼠中只发现一种miRNA-33，定位于SREBP-2内含子上[3-6]。miR-33不仅与其宿主基因共转录，还一起参与维持机体胆固醇和脂质稳态[7]。miR-33的主要靶基因为ATP结合盒转运子 A1 /G1基因(ATP-binding cassette transporter A1 /G1,Abca1/Abcg1)。通过与靶基因的3'-UTR 区相应序列结合，下调其表达，进而降低细胞胆固醇的外流、高密度脂蛋白(High-density lipoprotein,HDL)的合成及胆固醇的逆转运[3]；此外，miR-33还能靶向肉毒碱棕榈酰基转移酶(CPT1A)、肉碱 O辛基转移酶(CROT) 和羟烷基辅酶A脱氢酶B(HADHB)等参与脂肪酸 β 氧化的相关基因，从而减少脂肪酸的降解[6]。最近研究发现，miR-33还可靶向SREBP-1[8]。miR-33存在缺陷时，SREBP-1水平升高，脂肪酸合成增加并积聚于肝和脂肪组织。miR-33-/-小鼠出现肥胖和肝脂肪病变的主要机制是由于SREBP-1的过表达。
目前关于SREBP和miR-33的研究结果虽然大多来自哺乳动物，但有证据表明，二者在脊椎动物中高度保守[9-10]。对斑马鱼、大西洋鲑和金头鲷的研究显示，SREBP-1和鱼类的糖脂代谢有关，可调节脂肪酸合成或糖代谢相关基因的表达[9, 11]，在此过程中，miRNAs也可能作为上游因子，通过调控SREBP-1的表达而成为SREBP调节网络中的重要成员。我们在之前的研究中已克隆出草鱼(Ctenopharyngodon idella)SREBP-1 基因全长cDNA[12]，其中3'-UTR长度为1 282 bp。本研究利用microRNA(miRNA)预测软件预测出该基因3'-URT序列中含有两个与脂代谢相关的miRNA—miR-33和miR-16的靶序列。为进一步研究SREBP-1和miR-33在草鱼脂代谢中的作用及miR-33对 SREBP-1表达的调控，我们克隆了SREBP-1 基因 3'-UTR区含有miR-33靶序列的碱基片断，构建了含miR-33结合位点的报告基因载体，并在草鱼肝细胞中进行荧光素酶活性检测，明确miR-33在草鱼SREBP-1表达中的调控作用。
1 材料与方法 1.1 主要试剂和仪器草鱼肝细胞(L8824)，购自中国典型培养物保藏中心(China center for type culture collection,CCTCC)，呈贴壁生长；质粒pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vector、双荧光素酶检测试剂盒Dual-Luciferase Reporter Assay System购自Promega(美国)；gc-miR-33 mimic由上海吉玛制药技术有限公司合成；感受态细胞DH5α由北京鼎国生物科技有限公司提供。其他试剂有T4 DNA 连接酶(Thermo美国)、2×Es Taq Master Mix(CWBIO，北京)、RNAiso Plus、PrimeScript RT Kit (Perfect Real Time)(TaKaRa，大连)、限制性内切酶Sac I和Xba I(NEB，北京)、无支原体优质胎牛血清(四季青，杭州)、青链霉素(Sigma，美国)、DMEM 高糖培养基(Gibico，上海)和lipofectamine 3000(Invitrogen，上海)；主要仪器为全波长多功能酶标仪(Varioskan Flash，Thermo)。
1.2 靶向SREBP-1 基因3'-UTR 的miRNA 预测利用microRNA(miRNA)预测软件(http://regrna.mbc.nctu.edu.tw/html/prediction.html)，预测可能与SREBP-1基因 3'-UTR 相互作用的miRNA。按照生物信息学预测规则，寻找符合要求的miRNA。一般要符合两个原则，一是miRNA 5'的第2~8位的核苷酸序列(种子序列)要完全与SREBP-1 基因的3'UTR互补；二是考虑在不同物种中其保守性高低和结合的自由能大小。
1.3 构建pmirGLO-SREBP-1-3'-UTR双荧光素酶报告载体根据本课题组已克隆的SREBP-1基因3'-UTR区的碱基序列(KJ162572)和预测出的miR-33所在的靶序列，采用Premier 5.0软件设计PCR引物，序列为：SREBP-3'UTR-F1: 5'CCCGGGTCTAGATTCTTCCCAACAGTTCATCAC3';SREBP-3'UTR-R1: 5'CCCGGGGAGCTCATCCCAGACGATAACAGGTAA3'(加下划线分别为XbaⅠ、SacⅠ酶切位点序列，之前序列为保护碱基，引物的扩增产物长度应为379 bp，位于SREBP-1基因3'-UTR的第148~527 bp处)。提取草鱼肝脏总RNA，RT-PCR法获取SREBP-1的3'UTR片段。反应体系为：2×Taq Master Mix 10 μL，Forward primer(10 μmol/L) 1 μL，Reverse primer(10 μmol/L) 1 μL，cDNA 2 μL，无菌水补足20 μL。反应条件为：95 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，59.4 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min共35个循环；72 ℃延伸10 min；4℃ 保存。1%琼脂糖凝胶电泳分析PCR 反应产物，并对产物进行纯化。用SacⅠ和XbaⅠ对纯化的PCR产物和载体进行双酶切，然后T4酶连接(连接时PCR产物与荧光素酶报告载体的摩尔数之比为3∶1，连接体系共10 μL)。将连接产物导入 DH5α感受态细胞进行阳性克隆验证，双酶切及电泳检测正确后，送公司测序鉴定。鉴定正确的重组载体命名为pmirGLO-SREBP-1-3'-UTR。
1.4 瞬时转染草鱼肝细胞L8824将构建的pmirGLO-SREBP-1-3'-UTR载体感染草鱼肝细胞L8824。采用24孔板进行细胞培养，细胞接种密度为5×104。在含10%胎牛血清的DMEM培养液、28 ℃和5 % CO2条件下，培养至细胞密度达70%~85%时开始转染。转染细胞分为两组：只转染pmirGLO-SREBP-1-3'-UTR报告载体的为对照组，共转染pmirGLO-SREBP-1-3'-UTR报告载体和miR-33 mimic为处理组。每组细胞设6个平行。转染方法：吸去原培养液，每孔加入300 μL新鲜无血清培养液；然后每孔加入200 μL转染试剂[对照组转染试剂：4 μL报告载体(500 ng/μL)+1.5 μL Lipofectamine 3000+1 μL P3000 + 200 μL无血清培养液；处理组转染试剂：4 μL报告载体 + 1.5 μL Lipofectamine3000 + 1 μL P3000 + 2 μL miR-33 mimics(20 μmol/L)+ 200 μL 无血清培养液]；培养箱中培养48 h后检测荧光素酶活性。本实验重复3次。
1.5 荧光素酶活性测定采用全波长多功能酶标仪，按照Promega 公司提供的双荧光素酶检测试剂盒操作说明，分别检测对照组和处理组的荧光素酶活性。
1.6 统计学处理所有数据用SPSS 17.0统计软件进行t检验。分析结果以平均数±标准差(Mean ± SD)表示。当P＜0.05时 表示差异具有统计学意义。
2 结果与分析 2.1 靶向SREBP-1基因 3'-UTR 的miRNA预测结果预测结果显示：SREBP-1的3'UTR区存在两个与脂代谢相关的miRNAs靶序列，即miR-33和miR-16。miR-33的靶序列位于SREBP-1 基因3'-UTR的第433~463 bp处，miR-16位于第650~671 bp处。两个miRNA均从第二位碱基开始与靶序列互补配对(图 1)。
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图 1 预测的miRNA与SREBP-1基因 3'UTR靶序列的互补情况
Fig. 1 Base complementation between the predicted miRNAs and target sequences in SREBP-1 -3'UTR
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根据预测的miR-33在SREBP-1 3'-UTR的靶序列及其所在位置设计引物，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳显示为一条长度约380 bp的条带，与实际长度(379 bp)相符(图 2)，测序结果证实该片断基因序列完全正确。将扩增片断插入线性化的pmirGLO载体，再用双酶切鉴定，结果显示酶切后得到的片段与预期片段大小相符(图 3)。双向测序结果显示，重组载体中的SREBP-1-3'-UTR序列与PCR产物完全一致，也与GenBank数据库上的吻合，表明该序列已成功转入pmirGLO载体中。
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图 2 SREBP-1 基因3'UTR扩增产物电泳图
Fig. 2 PCR products of SREBP-1-3'UTR by 1% agrose gel
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图 3 pmirGLO重组载体双酶切结果
Fig. 3 The double digestion results of pmirGLO recombination plasmid
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对照组(只转染pmirGLO-SREBP-1-3'-UTR载体)和处理组(共转染pmirGLO-SREBP-1-3'-UTR载体和miR-33 mimic)细胞均检测到荧光素酶活性，但对照组酶活性(1.417±0.141)显著高于处理组(1.064±0.081)(P＜0.05，图 4)。miR-33mimics显著下调了pmirGLO-SREBP-1-3'-UTR荧光素酶报告载体的报告荧光，说明SREBP-1应是miR-33的靶基因。
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图 4 转染细胞的荧光素酶活性
Fig. 4 Relative luciferase activity of transfected cells
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miRNA和SREBP均是脂代谢调节网络中的重要成员。SREBP是哺乳动物肝脏脂肪生成基因的主要调节者[1-2]，不仅在脂类代谢中发挥重要作用，还参与对葡萄糖的代谢调节[13]。miRNA几乎参与了动物脂代谢的所有调节层次，包括脂肪细胞分化、脂肪组织能量代谢、肝脏脂类代谢和脂类代谢调节相关激素的分泌[14-15]。目前已确定包括miR-33、miR-122、miR-370、miR-378、miR-302a 和 miR-106b 在内的多个miRNA参与调控脂类代谢[16]，其中miR-33定位在SREBP基因的内含子上，与SREBP共表达，二者共同参与调控机体胆固醇及脂类稳态[7]。miR-33a不仅靶向调控Abca1、Abcg1、CPT1A、CROT等与细胞胆固醇稳态和脂肪酸氧化相关的基因[3, 6]，也是SPEBP-1表达的调节因子[8]，通过与SREBP-1 3'-UTR结合下调其表达。虽然已证实SREBP-1与miR-33在脊椎动物中高度保守[9-10]，但在鱼类中关于二者的研究并不多。我们在之前的研究中已克隆出草鱼SREBP-1 全长cDNA[12]。为验证草鱼SREBP-1是否如哺乳动物一样是miR-33的靶基因，本研究先通过软件预测靶向SREBP-1基因的miRNA，发现miR-33和miR-16在SREBP-1的3'UTR区均存在可以互补配对的靶序列。为避免假阳性需通过实验的方法验证预测结果是否准确[17]。一般采用双荧光素酶检测和免疫印迹进行验证[18-19]，本研究选择双荧光素酶基因报告法，通过克隆含miR-33结合位点的SREBP-1的3'UTR序列，成功构建了SREBP-1-3'UTR双荧光素酶基因报告载体，并通过miR-33mimics和报告基因载体共转染草鱼肝细胞L8824，判断miR-33对细胞荧光素酶表达的影响。结果表明，miR-33mimics明显下调了SREBP-1-3'-UTR荧光素酶报告载体的报告荧光，说明SREBP-1是miR-33直接调控的靶基因，miR-33通过与SREBP-1 mRNA 3'UTR结合，对其进行转录后水平调控。本研究为进一步揭示miR-33与SREBP-1在草鱼脂代谢调控网络中的作用奠定了理论和材料基础。
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2. College of Fisheries, Henan Normal University, Xinxiang 453007, Henan, China