2016,
Vol. 25
2. 上海海洋大学 水产与生命学院, 上海 201306
彩虹明樱蛤(Moerella iridescens)属瓣鳃纲、樱蛤科,俗称海瓜子,肉质细嫩,味道鲜美,深受沿海居民喜爱。其分布于西太平洋沿岸和澳大利亚北部沿岸,在我国主要分布于浙闽沿海[1-2]。浙江乐清湾位于浙江南部瓯江入海口北侧、北纬27°59′～28°33′、东经120°57′～121°16′之间，沿岸有清江、白溪、水涨、灵溪、江下等30余条江河流入湾内，东侧为玉环县,西岸为乐清市，湾顶为温岭市,湾口为洞头岛屿，是一个贝类的天然良湾，也是彩虹明樱蛤自然资源的集中分布区[3]。
目前已对彩虹明樱蛤的养殖生态学、繁殖生物学等进行了研究[4-5]，而对彩虹明樱蛤种群遗传多样性的研究见于对江苏连云港、浙江慈溪、浙江平湖等3个群体进行过形态、同工酶和ISSR的分析，以及对浙江温岭群体进行过初步的RAPD分析[5-10]。而对于浙江，尤其是乐清湾的彩虹明樱蛤群体的遗传多样性，尚缺乏研究。本研究将从形态学和SRAP(Sequence-based amplified polymorphism，SRAP)标记入手，分析浙江省乐清湾区域彩虹明樱蛤群体结构，目的是探讨它的资源特色，为其种群鉴定、资源开发利用奠定基础。
1 材料与方法 1.1 材料采集2013年5月至7月采集了浙江沿海彩虹明樱蛤8个群体样本，其中乐清市野生群体3个、养殖群体1个；其余4个全部为野生群体，分别来自乐清湾沿岸玉环、温岭群体,以及浙江象山和舟山大洋山海区，具体采集信息见表 1。台州和温岭市尽管不属于乐清市，但地理位置上也在乐清湾海域内，尤其是温岭市,它与乐清市是邻接的。
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表 1 彩虹明樱蛤样本采集信息 Tab.1 Sampling Information of M. iridescens |
对8个采样群体，分别用游标卡尺(精确至0.1 mm)测量。选取彩虹明樱蛤的34个可量性状,壳前后缘点不容易确定，我们取4个(C、O、P、Q)为壳后缘点，3个(D、R、T)为壳前缘点，分别为壳长(CD、CR、CT)、壳高AB、壳顶到壳前缘距离(AD、AR、AT)、壳顶到壳后缘距离(AC、AO、AP、AQ、OR、OD、OT、PR、PT、PD、QR、QD、QT、CR、CT)、壳宽SW、壳顶到前闭壳肌痕外缘最大距离AE、壳顶到后闭壳肌痕外缘最大距离AF、前后闭壳肌痕外缘最大距离EF、前后闭壳肌痕内缘最小距离GH、壳顶到外套痕前缘最大距离AI、壳顶到外套痕后缘最大距离AJ；外套痕前后缘最大距离IJ,壳后缘到壳最低点最大距离(OB、CB、PB、QB)，壳前缘到壳最低点最大距离(BR、BT)。每个群体测得1 700项，每个群体50个个体、8个群体共获得13 600个数据。测量位点如图 1所示。
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图 1 彩虹明樱蛤形态学测量部位
Fig. 1 Landmark points for morphological measurement of Moerella iridescens
A.壳顶点； B.壳底点； C、O、P、Q.壳后缘点； D、R、T.壳前缘点； S.左壳点； W.右壳点； E.前闭壳肌痕外缘点； F.后闭壳肌痕外缘点； G.前闭壳肌痕内缘点； H.后闭壳肌痕内缘点； I.外套痕前缘点； J.外套痕后缘点。 A. Shell vertex; B. Shell bottom; C、O、P、Q. Shell edge point; D、R、T. Shell leading edge; S. Left shell point; W. Right shell point; E. Anterior adductor scar edge point; F. After the adductor scar edge point; G. Anterior adductor inner edge point; H. Posterior adductor scar inner point; I.Mantle scar; J. Mantle inner scar. |
SRAP标记主要针对开放读码框(ORFs) 的序列进行扩增，具有简便、稳定等优点，已广泛应用于多种作物的遗传多样性研究和图谱构建[11-12]。SRAP引物序列参考LI等[11] ,由上海生工生物工程公司合成，正向8条，反向8条，正反向随机组合，共有64对引物详见表 2。
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表 2 SRAP引物序列 Tab.2 The primer sequences of SRAP |
从每个群体中随机取出3个，共24个样本进行预实验。PCR产物经2%琼脂糖检测具有清晰条带的再用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，快速银染后拍照记录。选取其中6对扩增条带清晰、稳定的引物组合(F1/R3，F1/R6，F2/R2,F2/R6，F3/R6，F3/R8)，对每个群体20个个体(8个群体共160个个体)进行群体遗传多样性分析，银染显色后的图谱统计,每一条带视为一个位点,有带记为1,无带记为0,转换成数字矩阵再进行分析。
1.4 数据处理采用SPSS 19.0[13]统计软件进行聚类分析、主成分分析等多元分析，对8个群体进行形态差异分析；采用DnaSP 5.0软件计算序列中多态位点(S)、单倍型多样性(haplotype diversity,h)和核苷酸多样性(nucleotide diversity,π)、遗传多样性水平；用PopGene32(Version 1.31)分析遗传距离、遗传分化指数和AMOVA等[14-15]；根据Nei[16]的无偏差杂合率计算公式估算各个基因座位的平均遗传杂合度。基因座位多态率是根据LYNCH 和MILLIGAN[14]的泰勒展开式估计的。
2 结果 2.1 形态学参数分析 2.1.1 聚类分析为消除彩虹明樱蛤规格大小对参数值的影响,先将所有参数分别除以壳长予以校正,得到33个比例性状，再分别求出各组样本每个参数校正值的平均值，用平均校正值进行聚类分析。聚类分析采用层次聚类分析中的Q型聚类，其中遗传距离的计算采用欧式距离的最短系统聚类法。聚类结果显示(图 2)，舟山大洋山(ZS)为单独一支，其余7个群体聚为另一大支。在7个群体的聚类支上有2小支：一支为宁波王家村(NB)和乐清养殖塘(YQY)聚为一支；另一支为乐清湾的5个群体，包括台州芦蒲镇(TZ)和温岭坞根镇(WL)群体。
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图 2 8个彩虹明樱蛤群体平均联接的谱系图
Fig. 2 Average linkage of eight populations of M. iridescens
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主成分分析结果见表 3，总方差贡献率表示性状对这个群体的影响力，总方差越大则表明对这个群体的影响就越大。前5个主成分的总方差的贡献率累计达到97.3%，前1、2个主成分的贡献率分别为51.4%、19.0%。主成分1、2中负荷绝对值超过0.9的分别为AP、AO、AQ等10项性状。
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表 3 8群体彩虹明樱蛤34个性状的5个主成分贡献率 Tab.3 Contributory ratios and eigenvector loading of five principal components for thirty-four characters of eight populations of M. iridescens |
为了从量化水平上更准确地判别彩虹明樱蛤群体归属，并反映群体间的变异程度，应用33项比例性状对8个群体进行了判别分析，结果见表 4。8个群体判别准确率在46%~ 98%之间，综合判别率为75.5%。去除乐清雁荡镇跳头养殖塘群体(YQY)外，其余群体的判别准确率均低于85%，乐清跳头(YQ3)24%的个体被误判到温岭(WL)群体中；尤其是台州玉环群体(TZ)只有46%,这也说明浙江沿海彩虹明樱蛤野生群体之间形态相似性极高，区分困难。
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表 4 8个彩虹明樱蛤群体判别结果 Tab.4 The discriminant analysis of morphology of eight populations of M. iridescens |
以46对引物组合在8个群体、每个群体3个样本进行预分析，其中34对引物组合能扩增出稳定、清晰的条带，12对引物组合无扩增产物。选取6对扩增条带清晰、并且条带数量较多的引物组合(分别为F1/R6,F1/R8,F2/R2,F2/R6,F4/R6,F3/R6)在8个群共160个个体中进行扩增，各群体的遗传多样性分析见表 5。乐清湾养殖群体(YQY)和温岭群体(WL)多态位点均为68个为最多，但平均杂合度及Shannon指数等乐清湾养殖群体(YQY)是最高的；宁波群体(NB)多态位点、平均杂合度及Shannon指数等在8个群体中都是最低的。
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表 5 彩虹明樱蛤8个群体的SRAP遗传多样性 Tab.5 Genetic diversity of eight populations of M. iridescens based on SRAP |
进一步分析了各群体间的遗传分化程度(表 6)。11个群体之间的基因流Nm=1.516 9，遗传分化系数Gst=0.247 9。两两群体之间的遗传距离在0.011 1～0.233 8之间； 乐清湾包括台州(TZ)和温岭(WL)5个野生群体之间遗传距离较小，而与宁波(NB)、舟山(ZS)以及乐清湾养殖群体(YQY)之间的遗传距离较大；乐清湾养殖群体(YQY)与宁波(NB)和舟山(ZS)之间遗传距离更小些。
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表 6 彩虹明樱蛤8个群体遗传距离(对角线下方)及遗传相似度(对角线上方) Tab.6 Genetic distances (upper) and genetic similarity (lower) between eight populations |
对8个群体进行聚类分析,结果显示(图 3)乐清湾5个野生群体聚集一起，乐清养殖塘群体(YQY)与舟山(ZS)、宁波群体(NB)聚集一起。
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图 3 彩虹明樱蛤8个群体基于SRAP的遗传距离NJ树
Fig. 3 NJ tree among eight populations of M. iridescens based on SARP
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形态学参数和性状对种群进行判别较为直观而且经济，已在各种水生生物如鱼、虾、贝等中广泛应用，且起到了很好的判别效果[17-19]，李晓英等[7]也曾利用该方法对杭州湾和海州湾彩虹明樱蛤3个群体进行了判别，判别结果认为地理距离更近的群体，形态上就更为相似，这个结论与本文研究结果基本一致。浙江沿海8个彩虹明樱蛤群体，尽管具有较高的形态相似性，导致判别准确率下降，但乐清湾5个野生群体形态更为相似，聚为一支；而宁波和乐清湾养殖群体具有较高的形态相似性。
SRAP分析结果显示，乐清湾地区彩虹明樱蛤野生群体遗传多样性普遍较高，这与董志国等[9]的研究结果一致，高于宁波和舟山地区的；但乐清湾地区彩虹明樱蛤群体间的遗传距离小，小于乐清湾以外的舟山和宁波群体。乐清湾养殖群体和温岭群体多态位点最多，均为68个，平均杂合度及Shannon指数等在乐清湾养殖群体中是最高的，而宁波群体多态位点、平均杂合度及Shannon指数等在8个群体中都是最低的。结合遗传距离聚类树进行分析，发现乐清湾养殖群体与舟山和宁波群体具有更小的遗传距离和更近的亲缘关系，但舟山和宁波群体间遗传距离却比较大，这可能是由于乐清湾养殖群体与这两个地区的彩虹明樱蛤之间存在混杂或引种的问题。
形态学和SRAP标记的研究结果都显示，乐清湾内野生群体之间具有更高的相似性和更近的遗传关系，群体遗传多样性较高，推测湾内目前的种质情况良好,但养殖群体在形态和遗传上与湾外群体的相似性，暗示乐清湾彩虹明樱蛤可能存在异地引苗的现象，这对当地彩虹明樱蛤群体的遗传结构可能造成影响，可能会打破原有的遗传结构，也可能会影响到当地原有的资源特色，因此要加强彩虹明樱蛤种质资源保护和管理。
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2. College of Aquaculture & Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China