全氟辛烷磺酸(Perfluorooctane Sulfonate,PFOS)是一种新型的持久性有机污染物，离子式为C₈F₁₇SO₃^-。作为完全氟化的阴离子表面活性剂，PFOS通常以盐的形式或渗入较大的聚合物中被广泛使用，生活中最常见的是钾盐(C₈F₁₇SO₃K)。由于PFOS具有良好的表面活性和疏水疏油特性，自其生产以来就被广泛应用于纺织、造纸、食品包装、地毯、皮革、洗发香波和灭火泡沫等工业和民用行业^[1]。然而，PFOS极高的化学稳定性、生物惰性及不易挥发性使得其在生态系统中很难降解，目前在世界范围内的水、大气、沉积物等环境介质，人体和动物的肝脏、血清中均有检出，已成为威胁环境及人类健康的重要污染物质之一^{[2, 3, 4]}。2003年PFOS被列入保护东北大西洋海洋环境公约(OSPAR)下的优先行动化学品名单，并被列入联合国欧洲经济委员会(UN-ECE)的远程越境空气污染公约(LRTAP)下的POPs议定书中。2009年，PFOS被列入POPs公约附件B。但是作为PFOS的生产大国之一的中国及一些亚洲发展中国家尚缺乏相应的监管政策^[5]。

PFOS进入环境后，可通过地表径流、淋溶、降雨、降雪等多种途径，最终归宿于各种水体之中，因此研究PFOS对水生态系统的危害十分必要。鱼类作为水生态系统的主要组成,可通过直接从水体吸收或食物链的传递摄入环境污染物而中毒，能够直接反映水体的污染状况，斑马鱼即为水生态毒性实验常用模式生物之一。研究表明，PFOS除对斑马鱼胚胎及仔鱼具有显著的发育及行为毒性外^{[6, 7]}，还会显著干扰斑马鱼的内分泌，其毒性作用机制可能是类雌激素效应，其血液及头尾匀浆中的卵黄蛋白(VTG)含量可作为PFOS内分泌干扰效应评价的敏感生物标志物^{[8, 9]}。胡芹等^[10]研究表明，PFOS暴露7 d会对斑马鱼鳃组织造成严重损伤，且损伤程度存在剂量-效应关系。本文将就PFOS对斑马鱼头部、内脏团和肌肉的生理生化毒性效应开展研究，以期为水环境安全评价提供相关依据，也为进一步探讨PFOS的毒性作用机理奠定理论基础。

仪器包括2048-UV/VIS紫外分光光度计(Unico)、DK-S24型电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司)和Centrifuge 5810R超低温高速冷冻离心机(eppendorf)。

全氟辛烷磺酸钾(C₈F₁₇SO₃K)购自美国Sigma公司； ALP、AchE、SOD、CAT、MDA、LDH试剂盒均购自南京建成生物试剂有限公司。

实验斑马鱼购自上海海草水族店，平均体长(3.23±0.34)cm，平均体质量(0.45±0.09)g。正式实验开始前，先将斑马鱼放置于小型循环水系统中，实验用水提前曝气48 h充氧除氯，控制水温在(25±2)℃，将斑马鱼暂养7 d，暂养期间斑马鱼自然死亡率＜2%，每天定时投喂，直至实验前24 h停食。

程艳等^[11]的急性毒性实验结果表明，PFOS对斑马鱼的96 h-LC₅₀为30.2 mg/L，由于预实验中PFOS最高浓度设为96 h-LC₅₀值的1/2，即15 mg/L时，斑马鱼出现死亡，而本实验主要探讨亚急性剂量下PFOS对斑马鱼的生理生化毒性影响，需要在实验过程中以保证受试斑马鱼不死亡为前提，因此将PFOS最高浓度设为96 h-LC₅₀值的1/3，即10 mg/L，以确保实验期间斑马鱼不死亡。采用静水式实验法，实验期间不换水。取4个10 L玻璃缸，高锰酸钾消毒洗净后加入7.9 L已曝气除氯的自来水，每缸放入135尾斑马鱼后暂养12 h，使斑马鱼适应当前水环境，之后分别向各缸加入相应的PFOS储备液100 mL，使各组PFOS浓度依次为0、1、5和10 mg/L。在实验暴露的第0、0.5、1、3、6、12、24、48和96 h取样，每缸随机捞取15尾鱼，其中每5尾鱼的相应组织混合后成为一个样，做3个平行。将鱼置于冰上立即冷冻致死，进行组织分离。取斑马鱼的头部、内脏团以及肌肉组织3部分进行测定，将所取组织以0.86%生理盐水洗净，滤纸吸干水分称重，按照1∶9(质量∶体积)向组织中加入相应体积的生理盐水，冰上匀浆制成10%的组织匀浆液，之后4 ℃ 6 000 r/min离心10 min取上清，-20 ℃冷冻保存待测。

将-20 ℃冷冻保存的粗酶液置于4 ℃冰箱解冻，使用所购试剂盒对其进行各酶活及MDA含量的测定。头部主要测其蛋白(TP)含量、ALP、LDH及AchE活力；内脏团主要测其蛋白(TP)、ALP、SOD、CAT活力及MDA含量；肌肉组织主要测其蛋白(TP)、ALP、SOD、MDA含量。测定前摸索得SOD最佳取样量为5%匀浆液0.05 mL，CAT最佳取样浓度为10%匀浆液0.05 mL，LDH最佳取样量为0.2%匀浆液0.05 mL。

使用Excel 2010整理实验数据，SPSS 17.0 统计软件对数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA),使用最小极差法(LSD)进行多重比较，P＜0.05表示与对照组存在显著性差异，P＜0.01表示与对照组存在极显著差异。

图1显示，暴露于1 mg/L处理组的斑马鱼头部ALP活力与对照组无显著差异； 5 mg/L组ALP活力在0.5 h和1 h时与对照组存在显著差异(P＜0.05)； 10 mg/L组ALP活力与对照组在0.5 h存在极显著差异(P＜0.01)，在1 h有显著差异(P＜0.05)，ALP活力受到抑制；之后3~96 h，各组ALP活力恢复，且与对照组均无显著差异，恢复至正常水平。由此可知，短时间(0.5、1 h)暴露时，中浓度组(5 mg/L)和高浓度组(10 mg/L)斑马鱼头部ALP活力受到抑制。

图1(Fig.1)

图1 PFOS对斑马鱼头部ALP活力的影响 Fig.1 Effects of PFOS on ALP activity of head in Danio rerio “*”表示处理组与对照组存在显著差异(P＜0.05)；“**”表示处理组与对照组存在极显著差异(P＜0.01),Fig.2-Fig.10同。 “*”：P＜0.05 represent significant differrence with control group;“**”：P＜0.01 represent extremely significant difference with the control group. The same as Fig.2-Fig.10.

各浓度组斑马鱼头部LDH活力在暴露后的0.5~1 h与对照组相比均未出现显著差异(图2)；1 mg/L组LDH活力在6、96 h受到诱导(P＜0.05)，与对照组相比存在显著差异；5 mg/L组LDH活力在3、6、96 h受到显著诱导(P＜0.05)，在48 h受到极显著诱导(P＜0.01)；10 mg/L组在整个实验期间的LDH活力与对照组无显著差异(P＞0.05)。

图2(Fig.2)

图2 PFOS对斑马鱼头部LDH活力的影响 Fig.2 Effects of PFOS on LDH activity of head in Danio rerio

0.5 h时中高浓度组斑马鱼头部AchE受到抑制，与对照组相比，5 mg/L组斑马鱼头部AchE活力受到明显抑制(P＜0.05)，10 mg/L组AchE活力与对照组存在极显著差异(P＜0.01)；在1~48 h，各暴露组斑马鱼头部的AchE活力并未受到显著影响(P＞0.05)；在96 h，各暴露组AchE活力受到一定程度的诱导，其中1 mg/L和10 mg/L组受诱导效果显著(P＜0.05),见图3。

图3(Fig.3)

图3 PFOS对斑马鱼头部AchE活力的影响 Fig.3 Effects of PFOS on AchE activity of head in Danio rerio

由图4可知，1 mg/L组斑马鱼内脏团中ALP活力与对照组均无显著差异(P＞0.05)；5 mg/L组在0.5 h时的ALP活力受到显著诱导(P＜0.05)；10 mg/L组在3 h时与对照组相比受到极显著诱导(P＜0.01)；48 h时，中高浓度组(5 mg/L和10 mg/L)ALP活力受到显著诱导(P＜0.05)。

图4(Fig.4)

图4 PFOS对斑马鱼内脏团ALP活力的影响 Fig.4 Effects of PFOS on ALP activity of visceral in Danio rerio

图5显示各组染毒之后的0.5 h内脏团SOD活力均受到极显著诱导(P＜0.01)；1 h时5 mg/L和10 mg/L组SOD活力受到诱导，与对照组存在显著差异(P＜0.05)；在3和24 h，高浓度组(10 mg/L)SOD活力受到显著诱导(P＜0.05)，12 h时1 mg/L组受到显著诱导(P＜0.05)。实验开始后的3~96 h所测得SOD活力值均较0.5和1 h的SOD活力低。

图5(Fig.5)

图5 PFOS对斑马鱼内脏团SOD活力的影响 Fig.5 Effects of PFOS on SOD activity of visceral in Danio rerio

图6显示1 mg/L组斑马鱼内脏团中CAT活力在染毒后0.5 h和1 h受到显著诱导(P＜0.05)；5 mg/L组CAT活力在48 h受到显著诱导(P＜0.05)；10 mg/L高浓度组CAT活力在实验过程中与对照组相比无显著差异(P＞0.05)。

图6(Fig.6)

图6 PFOS对斑马鱼内脏团CAT活力的影响 Fig.6 Effects of PFOS on CAT activity of visceral in Danio rerio

图7表明，除6 h和96 h，其余时间点各暴露组斑马鱼内脏团MDA含量均出现不同程度上升，各组基本在染毒后的0.5~1 h和12~24 h这两个时间段出现显著(P＜0.05)或极显著(P＜0.01)上升，12~24 h各组斑马鱼内脏团MDA含量低于0.5~1 h时间段；从暴露浓度来看，低浓度组(1 mg/L)在1 h、24 h与对照组存在极显著差异(P＜0.01)，在12 h与对照组存在显著差异(P＜0.05)；5 mg/L组在0.5 h、1 h极显著上升(P＜0.01)，在12 h及48 h显著上升(P＜0.05)；10 mg/L组在0.5~3 h，12~24 h这两个时间段与对照组之间存在极显著差异(P＜0.01)，48 h时存在显著差异(P＜0.05)。

图7(Fig.7)

图7 PFOS对斑马鱼内脏团MDA活力的影响 Fig.7 Effects of PFOS on MDA activity of visceral in Danio rerio

图8显示，同一时间不同浓度组，1 mg/L低浓度组斑马鱼肌肉中ALP活力在0.5 h受到极显著诱导(P＜0.01)，在6 h受到一定程度的抑制(P＜0.05)；5 mg/L组ALP含量在0.5、1、6、12及96 h均受一定程度的抑制，其中在1 h和96 h抑制效果明显(P＜0.05)，在0.5、6和12 h抑制效果极明显(P＜0.01)；10 mg/L浓度组ALP活力在0.5、1、6和12 h受到一定程度的抑制，其中在0.5、6和12 h 时受到极显著抑制(P＜0.01)，在1 h 受到显著抑制(P＜0.05)。

图8(Fig.8)

图8 PFOS对斑马鱼肌肉中ALP活力的影响 Fig.8 Effects of PFOS on ALP activity of muscle in Danio rerio

同一浓度不同时间点斑马鱼肌肉中SOD活力在实验过程中随时间变化不明显，基本稳定(图9)。各暴露组中，仅5 mg/L组斑马鱼肌肉SOD活力在12 h和96 h受到明显抑制，与对照组存在显著差异(P＜0.05)，其余浓度组与对照组之间均无显著差异(P＞0.05)。

图9(Fig.9)

图9 PFOS对斑马鱼肌肉中SOD活力的影响 Fig.9 Effects of PFOS on SOD activity of muscle in Danio rerio

如图10所示，1 mg/L低浓度组MDA含量在0.5 h受到极显著诱导(P＜0.01)，在96 h受到明显抑制(P＜0.05)；5 mg/L组则在12 h、48 h受到明显抑制(P＜0.05)；10 mg/L高浓度组MDA含量则在0.5、12和96 h受到显著抑制，与对照组存在显著差异(P＜0.05)。

图10(Fig.10)

图10 PFOS对斑马鱼肌肉中MDA活力的影响 Fig.10 Effects of PFOS on MDA activity of muscle in Danio rerio

碱性磷酸酶(ALP)是一种非特异性磷酸单酯酶，是含有锌、镁离子的金属酶 ^{[12, 13]}。作为一种磷酸水解酶，ALP参与生态系统的能量转化和物质循环，在水生态系统中更是发挥着标志性作用，其活性大小反映了水体的磷营养水平，对水体的富营养化研究具有关键作用^[14]。ALP广泛存在于几乎所有生物体内，尤以肝脏、骨骼、肠、肾和胎盘等组织中分布最多。在生物体内ALP可直接参加磷的代谢,并在钙、磷的消化吸收和分泌以及骨化过程中发挥重要作用^{[15, 16]}。

实验中，斑马鱼头部ALP活力仅中高浓度暴露组在0.5 h和1 h受到显著抑制，之后逐渐恢复，而低浓度组在整个实验过程中与对照组均无显著差异。斑马鱼肌肉中的ALP活力除低浓度组在0.5 h受到极显著诱导，其余均在实验过程中受到不同程度的抑制。施志仪等^[17]研究指出，ALP有促进钙代谢的作用，当ALP受到抑制时，生物体内钙含量越低。本实验中斑马鱼头部和肌肉中ALP酶活的变化可能会导致其钙代谢的异常，进而影响其正常生长，这需要后续实验的验证。斑马鱼内脏中的ALP活力随暴露时间的延长和暴露浓度的增加有所上升，中高浓度组ALP活力受诱导效果显著。出现这一现象可能是由于PFOS胁迫激活了斑马鱼内脏组织的免疫机制，为抵抗PFOS所造成的不良影响，新陈代谢加快使得ALP活力升高，此外高浓度的PFOS暴露可能对斑马鱼的内脏组织造成了一定的损伤。研究表明。ALP具有种属特异性和组织特异性^[18]，因此实验中ALP升高具体是由哪些组织变化引起还需进一步探讨。

乳酸脱氢酶(LDH)是糖酵解过程中的一种重要酶，广泛存在于各生物体心肌、骨骼肌、肾和肝脏中，LDH活力的变化会影响机体的能量代谢，其活力的高低一定程度上体现了骨骼肌和肝脏等组织中无氧代谢能力的强弱^[19]。相关实验表明，在缺氧条件下，小鼠体内及黄尾平口石首鱼肝脏中的LDH活力显著升高^{[20, 21]}。此外，LDH也可作为生物体中枢神经系统损伤的重要敏感指标，当生物体脑组织受损或坏死时，脑脊液中的LDH活力会增高^[22]。实验中，斑马鱼头部LDH活力在0.5~1 h受抑制，但与对照组无显著差异，这是由于PFOS胁迫斑马鱼出现了急性应激反应。之后3~96 h中低浓度组LDH又受到显著诱导，说明长时间暴露于PFOS中，可能会使斑马鱼的中枢神经系统受到一定程度的损伤。

乙酰胆碱酯酶(AchE)是一种主要存在于生物体神经系统的水解酶，它能够催化和水解神经递质中的乙酰胆碱，主要存在于胆碱能神经末梢突触间隙,特别是运动神经终板的突触后膜皱褶中^[23]。AchE除了可作为评价有机磷和氨基甲酸酯类农药污染的靶标酶，也可作为评价神经毒剂对水生生物毒性效应的标志性酶^[24]。一般认为，AchE活力受到抑制会使得生物体发生运动和平衡失调，并且影响生物的摄食和逃避反应，对生殖有一定影响^[25]。PFOS会影响神经递质表达，并对突触形成和突触可塑性有影响^[26]。SLOTKIN 等^[27]用PFOS 染毒分化和未分化的PC12 细胞，结果发现PFOS 能够诱导PC12 细胞远离多巴胺型而趋向于分化成乙酰胆碱型的神经细胞。赵于丁等^[28]指出，20%的AchE抑制率说明污染物对生物体造成毒害，高于50%的AchE抑制率说明对生物生存造成危害。本实验中，中高浓度组斑马鱼头部AchE活性在0.5 h受到显著抑制，这可能是由于斑马鱼受到PFOS胁迫，产生了应激反应，脑中乙酰胆碱型的神经细胞增多，AchE酶为水解过多乙酰胆碱而有所降低。紧接着其AchE活力在1 h受到诱导，之后下降恢复至正常水平。96 h时，低浓度组和高浓度组AchE活力又受到显著诱导。脑组织中AchE含量的上升可能与其脑组织中酶蛋白的加速合成有关^[29]，本实验中AchE活力的升高可能是斑马鱼为克服PFOS胁迫所带来的不良环境影响，加快了AchE酶蛋白合成的速度，以保护机体免受损伤。

生物由于受到不良环境的影响胁迫，细胞内会产生大量的活性氧自由基(ROS)，包括过氧化氢(H₂O₂)、羟自由基(-OH)和超氧阴离子自由基(O₂^-)等有害物质。而超氧化物歧化酶(SOD)能够起到清除机体中有害的超氧阴离子自由基(O₂^-)，保护细胞免受损伤，维持机体的氧化与抗氧化平衡，有效清除和降解异源物质的重要作用^{[30, 31]}，其活性大小常被用于表征生物机体抗氧化性的强弱^[32]。SOD的诱导效应通常被认为是机体为克服不良环境的适应性改变，抑制则被认为是机体对环境胁迫较敏感，受到了一定的损伤^[33]。

本实验中，斑马鱼内脏团SOD活力在0.5和1 h受到显著诱导，之后随时间有所降低，但未受到抑制，3 h和24 h的10 m/L浓度组与12 h的1 mg/L浓度组的SOD活力依旧受到诱导。0.5~1 h SOD活力的显著升高，可能是由于斑马鱼受PFOS胁迫，体内突然产生了大量的氧自由基，激活了免疫机制，通过加速SOD酶的合成来清除过来自由基，维持氧化与抗氧化平衡，是斑马鱼的一种应激反应。之后SOD活力随时间降低，说明在PFOS长时间暴露下，自由基产生越来越多，使得机体清除速度变慢，但SOD活力并未受到抑制且在个别点受到显著诱导，则说明在本实验浓度下，PFOS未对斑马鱼内脏团造成显著的氧化损伤。肌肉中各浓度组SOD活力在3、6、12、48和96 h与对照组相比均受到一定程度的抑制，其中5 mg/L浓度组在12 h和96 h受到抑制效果显著(P＜0.05)，表明PFOS暴露使得斑马鱼肌肉中氧自由基增加，SOD酶无法及时清除从而造成氧化损伤。对比斑马鱼内脏团与肌肉中的SOD活力发现，内脏组织中SOD活力较肌肉中高，对PFOS的响应更明显。

过氧化氢酶(CAT)也是一种抗氧化酶，它能使机体中的H₂O₂自由基分解为H₂O和O₂，防止H₂O₂与O₂反应生成有害的羟基(-OH)。过氧化氢酶存在于所有已知动物的组织中，尤以肝脏中浓度最高。通常情况下，CAT会与SOD联合作用，共同清除体内由于不良环境胁迫所产生的过量自由基，保护机体免受损伤。本实验中各暴露组CAT活力受到一定程度的诱导，1 mg/L低浓度组CAT活力在0.5 h和1 h受到显著诱导，与对照组存在显著差异，5 mg/L浓度组CAT则在48 h受诱导效果显著。说明在实验浓度范围内，低浓度PFOS刺激了斑马鱼内脏中CAT活力，使其清除氧自由基的能力加强，产生了“毒性兴奋效应”^[34]。王贺威等^[35]研究发现，PFOS暴露1 d后，低浓度组真鲷鳃组织SOD和CAT活力均受到显著诱导，而高浓度组与对照组相比差异不显著或出现受抑制现象，也产生了“毒性兴奋效应”。

丙二醛(MDA)是氧自由基攻击生物膜中多不饱和脂肪酸而引发脂质过氧化从而形成的一种脂质过氧化物。当机体受到不良环境的胁迫时，体内会有大量氧自由基产生，损伤生物膜进而导致MDA含量升高。因此，MDA含量可反映机体内的脂质过氧化程度，从而间接反映细胞的损伤程度^[36]，其含量越高，机体膜脂质过氧化损伤越严重。

斑马鱼内脏中MDA含量经PFOS暴露后中高浓度组在0.5 h和1 h受到显著诱导，MDA含量明显上升,但对应的SOD活力也受到诱导，这可能是因为PFOS进入斑马鱼体内后，使得斑马鱼内脏中产生了大量的氧自由基攻击生物膜，这激活了鱼体内的免疫机制，使得SOD活力增加以清除过量自由基保护组织免受损伤。之后3~6 h MDA含量有所降低，说明生成的SOD能够及时清除机体中过量自由基，维持氧化与过氧化平衡，但是接着的12~48 h，MDA含量又显著增长，这说明随着时间的延长，机体中的氧自由基积累越来越多，使得SOD抗氧化能力降低，无法及时清除过量自由基，机体内的氧化与抗氧化平衡被打破，导致内脏组织受到了一定的膜脂质过氧化损伤。而肌肉中的MDA含量，除了1 mg/L低浓度组在0.5h时受到了显著诱导，其他均在实验过程中受到抑制，说明在本实验条件下，PFOS对肌肉的膜脂质过氧化损伤影响并不大，其中SOD能够清除由于PFOS暴露产生的过量活性氧自由基。

结果表明，一定浓度的PFOS会抑制斑马鱼头部AchE活性，诱导LDH显著升高，具有一定的神经毒性，会影响斑马鱼的中枢神经系统，对脑组织造成一定的损伤。头部ALP、AchE和LDH 3种酶活性对PFOS的敏感性为LDH大于ALP和AchE；内脏组织受PFOS胁迫MDA含量显著升高，ALP也受到一定程度的诱导，PFOS对内脏组织造成了一定程度的膜脂质损伤，且所测4种酶对PFOS的响应敏感度为MDA＞ALP＞SOD＞CAT；肌肉中ALP受到显著抑制，所测3种酶对PFOS的响应敏感度为ALP＞MDA＞SOD。内脏团和肌肉中的ALP活性对PFOS的响应要比头部敏感，内脏团中SOD和MDA对PFOS的响应比肌肉中敏感。