2017,
Vol. 26
2. 上海海洋大学 省部共建水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室, 上海 201306
盐碱地长期以来被认为是一种重要的可复垦开发利用的土地资源。在我国西北干旱半干旱地区，有约0.13亿公顷的盐碱地存在[1]。西北干旱地区水域水质具有高pH和高碱性的特点，且部分水域离子比例失调，水体情况较为复杂，因此绝大部分水域长期荒芜，不仅影响区域生态环境改善，而且造成经济社会发展相对滞后。
目前对盐碱地区水域的改良方法主要有：人工盐碱地水体淡化、种植耐盐耐碱水生植物、发展咸水-微咸水养殖等，其中水产养殖和生态恢复是目前较为普遍的手段。这样不仅可充分利用原本无法利用的盐碱水域资源，而且能产生较好的经济效益和环境效益。枝角类作为生态修复过程中的关键物种，同时又是优质的动物蛋白型饵料，其在盐碱地的人工养殖就显得尤为重要。
本文研究了不同pH和盐度影响下大型溞的心率和摄食行为的变化情况，旨在找到大型溞在盐碱胁迫下心率和摄食行为的规律，为大型溞在盐碱地区的开发利用提供必要的理论基础。
1 材料与方法 1.1 实验种类大型溞(Daphnia magna)取自上海金山区朱行基地实验室多年驯化的纯种品系。日常培养条件：培养用水为盐度1~2、经200目网孔过滤的井水，pH为7.5±0.2，硬度为180 mg/L；培养温度为(22±1) ℃，光强为(2 500±500) lx，光暗比为14h:10 h。同时喂以密度为105 cell/mL的铜绿微囊藻。实验中幼龄溞采用培养三代以上、溞龄小于12 h、未经第一次蜕皮的幼龄溞，大龄溞采用经三代以上、培养达到(12±1) d、经5次蜕皮且体型状态相当的大型溞。
铜绿微囊藻藻种购自中国科学院野生生物种质库淡水藻种库，利用BG-11培养基在恒温光照培养箱中培养，温度为(25±1) ℃，光照条件为3 000 lx，光暗比12 h:12 h，每天震摇3~5次。实验时藻细胞处于旺盛的对数生长期，将藻液离心收集，按比例稀释到所需浓度。实验期间所用器皿和培养液均需严格高温灭菌处理，所有操作过程均在超净工作台上进行。
1.2 实验方法 1.2.1 不同pH和盐度溶液的制备pH溶液的配制：先配制0.2 mol/L的HCl和NaOH溶液，再逐级稀释配制各浓度溶液，之后用pH计校准，确保pH准确。
盐度溶液的配制：用分析天平准确称取所需质量海水晶溶于蒸馏水中，用盐度计校准。
1.2.2 分离6~12 h的幼龄溞和12 d日龄的大龄溞实验前挑选产自同一母体、生长状态良好的抱卵大型溞50个，放入2 L烧杯中培养6 h。之后取出母溞，得到6~12 h的幼龄溞。12 d的大型溞取自连续培养三代以上、生长日龄在12 d左右，长势均一且未抱卵的大型溞。
1.2.3 大型溞的心率实验实验设置1、2、3、4、5、6、7和8等8个盐度和4、5、6、7、8、9、10和11等8个pH梯度。每个处理组中放置30只大型溞，设计3个平行，同时设计3个对照。实验用250 mL玻璃烧杯，200 mL实验溶液。在光照培养箱内暗培养5 h，温度(20±1) ℃，实验期间不喂食。从各处理中随机挑取成活的大型溞(以15 s内大型溞包括触角能活动为准)8只，通过体式显微镜和CCD显微影像设备记录大型溞的心跳。
1.2.4 大型溞的摄食行为实验实验设计同心率实验。另有3个空白组(双蒸水加藻液，无大型溞)。铜绿微囊藻的初始密度为3×105个/mL，在光照培养箱内暗培养5 h，温度(20±1) ℃，实验结束后，利用光密度法测定铜绿微囊藻密度。参照GAULD[2]的方法计算不同实验条件下的滤水率(F)和摄食率(I)。
(1)
(2)
(3)
式中：F为滤水速率，即单个大型溞在单位时间内滤过的实验液体积(μL/h)；A为校正因子，以蒸馏水加藻液，不添加大型溞的对照组来计算；I为摄食率，即单个大型溞单位时间内摄食的藻细胞数量(cells/h)；V为实验液体积(μL)；n为每组大型溞只数；Ct为t时间后不放大型溞的空白组藻液浓度(cells/μL)；C0为初始藻液密度(cells/μL)；Ct为大型溞摄食后的藻液密度(cells/μL)；t为实验时间(h)。
1.3 数据处理运用Excel 2007软件进行数据整理，采用SPSS 17.0统计软件进行单因素方差分析。P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。
2 结果与分析 2.1 pH和盐度对大型溞心率的影响图 1是在不同pH下，两种生长期大型溞的心率变化，它们对pH的响应都存在差异性。与对照组相比，幼龄溞心率在pH为7~8时无显著差异；pH为6、9时，幼龄溞心率显著升高(P＜0.05)，这时不适的pH浓度能刺激幼龄溞的代偿作用，心率升高；这种代偿作用在pH为10时更大，心率升高极为显著，达到(372.1±15.1) 次/min；而pH＜6和pH>10时，心率下降，当pH为4时极显著(P＜0.01)，达到(230.1±10.1) 次/min，说明此时幼龄溞心率受到抑制，幼龄溞对酸的耐受性弱于对碱的耐受性。大龄溞的心率随pH的变化规律与幼龄溞相似，pH为7~9时无显著差异；pH为6和10时心率显著升高(P＜0.05)；pH为5和11时心率极显著上升。对比发现大龄溞对pH变化的适应性强于幼龄溞。
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图 1 不同pH下两种生长期大型溞的心率变化
Fig. 1 Changes in heart rate at different pH values at two ages of Daphnia magna
P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著，图表中分别用*和**标示, 图 2-6同 * indicates significant difference(P < 0.05);** indicates highly significant difference(P < 0.01), the same in fig. 2-6 |
图 2为两种生长期大型溞在不同盐度下的心率变化。幼龄溞在盐度为1~3时心率与对照组无显著差异；盐度4~5时随着盐度的升高，幼龄溞心率显著升高(4时P＜0.05，5时P＜0.01)，说明适当的低盐度刺激了幼龄溞，使其心率加快；当盐度大于5时，心率逐渐下降，说明当盐度值超过幼龄溞的耐受范围时会对其造成一定的伤害。大龄溞心率随盐度的变化规律与幼龄溞相似，但盐度升至5时才出现心率显著升高，6~7时达到最大，为345±12.10。盐度为8时才开始下降，说明大龄溞较幼龄溞耐盐阈值更高。
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图 2 不同盐度值下两种生长期大型溞的心率变化
Fig. 2 Changes in heart rate at different salinity at two ages of Daphnia magna
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图 3为不同pH对幼龄溞和大龄溞滤水率的影响。pH为6和8时幼龄溞滤水率略有升高，变化不显著(P>0.05)；在pH＜6时随着pH下降和pH>9时随着pH升高，幼龄溞滤水率均显著下降，说明幼龄溞保持高滤水率的最适pH范围为6~8。大龄溞滤水率随pH的变化规律与幼龄溞相似；在pH为7~9时，大龄溞滤水率与对照组无显著差异(P>0.05)；在pH＜7和pH>9时，大龄溞滤水率显著降低，说明大龄溞滤水率的最适pH范围在7~9之间，区间比幼龄溞宽。
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图 3 不同pH值下两种生长期大型溞滤水率的变化
Fig. 3 Changes in filtration rate at different pH values at two ages of Daphnia magna
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从图 4可以看出盐度对两种生长期大型溞滤水率的影响。在盐度小于2时，幼龄溞滤水率随盐度增加逐渐增高，盐度为2时达到最大值(231.12±15.31) μL/(ind·h)，差异显著(P＜0.05)；盐度大于2时，随盐度增大，幼龄溞滤水率迅速降低，大于4时达到极显著程度(P＜0.01)。从滤水率看，大龄溞的最适盐度范围较幼龄溞大，滤水率在盐度小于3时随盐度增大而升高，盐度3时达最大，为(678.63±27.89) μL/(ind·h)，且与对照组差异显著(P＜0.05)；当盐度大于3时滤水率下降，盐度大于6时差异极显著(P＜0.01)；相比幼龄溞，大龄溞耐盐性更强。
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图 4 不同盐度下两种大型溞的滤水率的变化
Fig. 4 Changes in filtration rate at different salinity at two ages of Daphnia magna
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图 5显示了pH影响下大型溞摄食率的变化。在pH为7时，幼龄溞摄食率与对照组无显著差异(P>0.05)，在pH为6(P>0.05) 和8(P＜0.05) 时甚至有所上升；pH＜6和pH>8时，幼龄溞摄食率显著降低(P＜0.05)，pH＜5和pH>9时极显著(P＜0.01)，说明幼龄溞摄食的适宜pH范围为6~8，超出此范围都会影响摄食率。大龄溞摄食率在pH为6~7时与对照组差异不明显(P>0.05)；pH为8~9时，较对照组显著升高(P＜0.05)；在pH＜6和pH>9时均随pH变化而显著下降(P＜0.05)，说明大龄溞摄食的最适pH为6~9之间，区间长度大于幼龄溞。
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图 5 不同pH下两种大型溞摄食率的变化
Fig. 5 Changes in feeding rate at different pH values at two ages of Daphnia magna
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图 6显示，盐度对幼龄溞摄食率有较大影响。当盐度为2~3时，幼龄溞摄食率显著增大；之后随着盐度增加，其摄食率急剧下降，盐度大于4下降显著(P＜0.05)，大于6时极显著(P＜0.01)。盐度对大龄溞摄食率的影响较幼龄溞小。在盐度为3时，大龄溞摄食率显著上升(P＜0.05)；之后随盐度增加，摄食率下降，盐度大于5时，其摄食率下降极显著(P＜0.01)。
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图 6 不同盐度下两种大型溞摄食率的变化
Fig. 6 Changes in feeding rate at different salinity at two ages of Daphnia magna
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pH作为水体重要的环境因子极大地影响着枝角类的生长繁殖。淡水枝角类的pH适应性较广，如多刺裸腹溞的最适pH在7.0~9.0之间，圆形盘肠溞的最适pH在5.0~9.0之间。pH急剧下降对枝角类生长繁殖和生理指标影响较大，但经过长期适应后并不会引起枝角类死亡，而只是降低其生长和繁殖能力[3]。
盐度是影响水生动物正常生理代谢的另一项重要指标。在一定范围内，随着盐度的不断升高，生物体新陈代谢和摄食不断增加；超过范围时，对其新陈代谢和摄食率产生抑制作用。GAUDY [4]指出，淡水盐度在4以内的升高会对大部分淡水动物的生长代谢和生殖有一定的刺激作用。邱德依、秦克静[5]研究发现，在盐度3~7间生长，鲤鱼的最大摄食率、生长率和能量转化率均显著高于饲养在淡水中的鲤鱼；何志辉等[6]也认为一定的低盐度对淡水动物的生活有积极作用。
3.1 pH和盐度对大型溞心率的影响大型溞心脏位于头部后方的背侧，拥有透明的心脏壁和壳瓣，心脏搏动可通过显微镜观察。大型溞心率作为敏感指标在毒理学中应用相当广泛。VILLEGAS等[7]和COROTTO等[8]报道了毒物对大型溞心率的影响。CLEMEDSON等[9]研究发现，尼古丁会使大型溞心率降低，乙醇则使其心率升高。BECKER等[10]发现鱼藤酮抑制大型溞心率。李志芬[11]研究了PFOS对大型溞生态效应的影响，结果表明：48 h后，在浓度小于100×10-6时随着PFOS浓度增加，大型溞心率显著增加，100×10-6之后大型溞心率受到抑制，但仍快于对照组。
本研究中，当pH和盐度变化时，不管是幼龄溞还是大龄溞，在适应外界环境变化过程中都表现出低促高抑的趋势，这与彭方[12]的研究结果相一致。接近大型溞最适pH范围的变化以及低盐度刺激会诱导大型溞心率加快，随着pH和盐度进一步变化，大型溞心率会出现一定程度的抑制。本实验中幼龄溞心率强于大龄溞，这与何志辉等[6]的研究结果一致。且幼龄溞对pH和盐度的变化较大龄溞敏感，适应性较差，这可能是12~16 h幼龄溞在体质和发育程度上都不及大龄溞，自身抗逆性系统还不完善，对外界刺激未形成完善的防御机制所致。另外，大型溞在实验期间不喂食，实验在8:00~13:00进行，而8:00~9:00是大型溞的摄食高峰，5 h饥饿也会对大型溞心率产生一定影响，且幼龄溞所受的影响较大龄溞大。本文仅从生理学角度阐述了pH和盐度刺激下大型溞心率的变化，其变化机制还需进一步研究。
3.2 pH和盐度对大型溞滤水率和摄食率的影响摄食行为作为水生动物的基本行为，能直观反映机体对外界环境的响应。枝角类的滤水率和摄食率作为其摄食行为的标志在毒理学和生态学中研究较为广泛。冯蕾[13]等发现温度、盐度和pH对壶状臂尾轮虫的滤水率和摄食率有显著的影响，最适摄食温度为25 ℃，最适盐度为20，最适pH为6~8。环境因子超过最适范围会显著降低壶状臂尾轮虫的滤水率和摄食率。罗艳蕊等[14]发现离子液体显著降低了大型溞的摄食率。WARE[15]研究认为外源毒物对大型溞摄食行为的中毒机制在于影响大型溞神经系统功能，降低或麻痹其协同能力，使摄食能力下降，造成营养不足，进而影响机体的正常生长和生殖。
本实验结果表明，幼龄溞和大龄溞滤水率和摄食率对pH和盐度变化的响应存在一致性。大龄溞摄食的最适pH和盐度分别为6~9和3，幼龄溞则为6~8和2，说明幼龄溞的适应性低于大龄溞，这与郑重[16]的研究结果一致。MARTINS等[17]也指出，在外界不良环境的适应性方面，枝角类幼体明显弱于成体。同时发现，不管是幼龄溞还是大龄溞，其对碱性水体变化的反应较酸性水体平缓，其耐碱能力高于耐酸能力。大龄溞的滤水率和摄食率高于幼龄溞，这与它们的口径大小、肠道发育及滤水量等有密切关系。另外，本实验所用大型溞经盐度为1~2的滨海井水培养，长时间的低盐度驯化也使其对盐度产生一定的适应性。所以当盐度上升时，其滤水率和摄食速率显著提高，随后才出现大幅下降；幼龄溞滤水率和摄食率峰值较大龄溞出现早，说明了大龄溞较幼龄溞对盐度具有更好的适应性。
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