东方鲀属(Takifugu)鱼类是隶属于鲀形目(Tetraodontiformes)的一个地域性分布类群，主要分布于日本岛至中国沿海海域^[1-3]。据中国动物志记载我国东方鲀属鱼类有22种，分布在珠江、长江等大的河口区及渤海、黄海、东海和南海等海域^[4]。该属鱼类肉质鲜美，但多数种类有剧毒，鱼种鉴别错误造成误食的事件也时有发生，东方鲀属鱼类形态差异不大，准确鉴定种类不易。AKIRA等^[5]对暗纹东方鲀(T. obscurus)等6种东方鲀构建分子系统发生树，表明东方鲀属内的亲缘关系很接近。此外，东方鲀属内近缘杂交频率较高^[6]，MASUDA等^[7]报道了黄鳍东方鲀(T. xanthopterus)与虫纹东方鲀(T. vermicularis)的天然杂交现象，杂交后代兼有亲本的性状，而近些年来放流规模不断扩大，有可能更促进了其属内的杂交^[8]。渤海海区也有红鳍东方鲀(T. rubripes)和假睛东方鲀(T. pseudommus)天然杂交种的报道^[9]。本研究在东海自然海区采集到15尾东方鲀属的鱼类，外形非常相似，其中，11尾个体的体表兼具点状和条状花纹，有些个体与任何目前描述东方鲀属鱼类的形态特征不一致，推测这些个体有可能是东方鲀属鱼类的杂交体，结合调查线粒体基因COⅠ和核基因组内含子序列，表明东海自然海区存在东方鲀属鱼类的杂交现象。

1 材料与方法 1.1 样本采集与形态学鉴定

2013年7月在上海市芦潮港收购到15尾野生河鲀，采样信息见表 1，参照中国动物志硬骨鱼纲^[4]与Fishbase网站(http://fishbase.org/)初步鉴定为东方鲀属，但由于其体表花纹不尽相同，分别为纹状、点状和点纹兼有的个体，与已知东方鲀属鱼类的体表描述有一定差异，故无法确定其确切的种类。在分别对所有个体拍照、编号并测量其体长、体质量后，取每尾个体的背部肌肉组织，用95%乙醇固定，4 ℃保存备用作后续基因序列分析。另外在上海芦潮港和上海崇明收购到野生黄鳍东方鲀和双斑东方鲀，在上海市水产研究所和江苏靖江购得养殖的暗纹东方鲀和菊黄东方鲀(表 1)。

1.2 DNA提取、PCR扩增及测序

取约100 mg肌肉组织经蛋白酶K消化后，使用酚/氯仿法抽提基因组DNA，经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，-20 ℃保存。从NCBI数据库中下载暗纹东方鲀等东方鲀属所有已有的11种鱼的COⅠ基因序列，比对之后在此基因保守区设计引物，引物序列为F: 5′-CACCCTATACCTAGTTTTTGGTGCC-3′、R: 5′-GAAGGTTGTATTTAGGTTTCGGTCA G-3′，扩增片段长度610 bp；此外，采用了EPIC标记技术，选用了两对非模式硬骨鱼跨越内含子通用引物^[10]55378E1 F: 5′-ATGARGAAAATGAGGCCAACTT GCT-3′，R: 5′-GCCACCTGKGTATTGATTATA GCTGAG-3′与55305E1 F: 5′-CCTAGTGGACT GTARTAACGCCCCYCT-3′,R:5′-AAGCCATCCAGTTTGCATAAACACTATC-3′。用于扩增COⅠ基因的PCR反应总体积为20 μL，其中包含：ddH₂O 8μL ，2×Taq mix 10 μL，上下游引物各0.5 μL和DNA模板1 μL。PCR反应条件为：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。用于扩增55378E1与55305E1片段的PCR反应总体积为20 μL，其中包含：ddH₂O 7.92 μL ，2×Taq mix 10 μL，上下游引物各0.64 μL,DNA模板0.8 μL。PCR反应采用两步法，条件为：95 ℃预变性30 s，98 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，15个循环；98 ℃变性10 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，15个循环。所有的PCR反应均在Eppendorf PCR仪上完成。每组PCR反应均设置阴性对照以检验是否存在污染。扩增产物使用1%琼脂糖凝胶电泳检测后，将目的产物使用天根DNA凝胶回收试剂盒回收，经连接、转化后，送上海生工生物工程有限公司测序。

1.3 系统发生分析

使用MEGA 5.2软件，基于Kimura-2-parameter双参模型计算遗传距离。从NCBI库中下载库内所有东方鲀属COⅠ基因序列，使用软件Clustal X比对序列，通过JModeltext对建树模型进行选择，分别使用软件RaxML，以GTRGAMA模型构建最大似然法系统进化树；使用Mrbayes软件，以GTRCAT模型构建贝叶斯法系统进化树，初步判断15尾未知东方鲀样本与已知东方鲀鱼类的进化关系。再将两个EPIC标记片段比对后联合进行分析，使用JModeltext对建树模型进行选择，分别使用软件RaxML，以GTRGAMA模型构建最大似然法系统进化树；使用Mrbayes软件，以GTRCAT模型构建贝叶斯法系统进化树。

2 结果 2.1 基于COⅠ基因序列的系统关系

为确定15尾杂交东方鲀的系统发生关系，克隆了此15尾个体及本实验室采集的暗纹东方鲀、双斑东方鲀、黄鳍东方鲀与菊黄东方鲀的COⅠ基因序列。所测定的19条COⅠ序列长度均为610 bp，无插入与缺失。其平均碱基组成为T：27.2%、C：30.5%、A：24.3%、G：18.0%，A+T含量为51.5%，G+C含量为48.5%，序列的碱基组成无明显的偏好性。19尾个体之间的平均遗传距离为0.005。

将测序得到的COⅠ序列比对分析，结果显示，所有个体均与暗纹东方鲀、菊黄东方鲀、双斑东方鲀COⅠ序列一致性大于98%；从NCBI库中下载所有已知东方鲀属鱼类COⅠ基因序列，包括暗纹东方鲀、星点东方鲀(T. niphobles)、横纹东方鲀(T. oblongus)、弓斑东方鲀(T. ocellatus)、豹纹东方鲀(T. pardalis)、斑点东方鲀(T. poecilonotus)、紫色东方鲀(T. porphyreus)、红鳍东方鲀、密点东方鲀(T. stictonotus)、虫纹东方鲀和黄鳍东方鲀，使用Clustal X软件比对序列，并以最大似然法与贝叶斯法构建系统发生树，使用SH检验两种系统发生树间的差异是否显著，结果显示基于COⅠ序列构建的两种系统发生树SH检验的P值均大于临界值0.05，即两种系统发生树之间无显著差异，故初步判断15尾杂交东方鲀样本与菊黄东方鲀、双斑东方鲀的进化关系最为相近,其次是横纹东方鲀，然后是暗纹东方鲀(图 1)。

2.2 基于内含子序列的系统关系

东方鲀属内的亲缘关系比较接近，为进一步调查此15尾鱼的种属关系，采用了两个核基因的内含子序列55378E1和55305E1。由于GenBank尚无此东方鲀属鱼类的内含子序列可供比较，我们只克隆和比较了此15尾个体以及本实验室所采集的菊黄东方鲀、双斑东方鲀和暗纹东方鲀的内含子序列。所测定的18条55378E1片段序列长度在1 032~1 066 bp之间，所有个体在256~278、362~368位点上均有不同个数的连续碱基G、在755~770位点上有不同个数的连续碱基TG，菊黄东方鲀、暗纹东方鲀与个体356在471~475位点上缺失5个碱基，18尾个体之间的平均遗传距离为0.011。所测定的18条55305E1序列长度在956~966 bp之间，361个体在269位插入碱基A，个体357、359与360在556~567位点缺失11个碱基，18尾个体之间的平均遗传距离为0.005。将2个内含子片段编辑在一起，分别构建最大似然法(图 2a)和贝叶斯(图 2b)系统进化树。使用SH检验两种系统发生树间的差异是否显著，结果显示基于2个内含子序列构建的两种系统发生树SH检验的P值大于临界值0.05，即两种系统发生树之间无显著差异，显示此15尾个体混杂在菊黄东方鲀、暗纹东方鲀和双斑东方鲀之中。

2.3 形态学数据

以上的分子系统关系表明此15尾个体与菊黄东方鲀、双斑东方鲀、暗纹东方鲀和横纹东方鲀关系最为接近。同样，此15尾个体的形态特征尤其是体纹、鳍条数目也与此4种鱼类相近。15尾个体的体纹可分为3类：点状个体、纹状个体和点纹兼有个体(表 2)。只有个体364和菊黄东方鲀一样，其背部密布白色圆点，此外，其背鳍鳍条数16，臀鳍鳍条数14，胸鳍鳍条数17，也与菊黄东方鲀的各鳍条数相似，因此，个体364有可能就是菊黄东方鲀。个体494、354和363背部全身均匀分布白色条纹，其臀鳍鳍条数14，只符合暗纹东方鲀的体纹和鳍条数的特征，很有可能就是暗纹东方鲀。而个体496的臀鳍鳍条数只有12，体纹是点纹兼有，符合横纹东方鲀的形态特征。其余10尾个体366、350、358、360、361、365、355、359、357和356为点纹兼有。在体纹和各鳍鳍条数等两方面，此10尾个体没有与菊黄东方鲀、双斑东方鲀、暗纹东方鲀和横纹东方鲀完全一致的描述。

3 讨论

相对于体内受精的种类，体外受精的鱼类种间天然杂交的现象更普遍^[11-13]，天然种间杂交后代形态学上兼具两种亲本的特征^[14]。在东方鲀属鱼类，已有关于种间天然杂交的报道，日本学者曾发现6尾未知东方鲀属鱼类，经形态学与同功酶分析认为此6尾鱼为虫纹东方鲀与黄鳍东方鲀的杂交后代^[7]。细胞色素b和12S rDNA基因序列分析表明，东方鲀属鱼类的进化关系较近，物种分化时间较短^[15] 。在东方鲀属中，菊黄东方鲀、双斑东方鲀、暗纹东方鲀和横纹东方鲀之间的进化关系十分接近^[5]，此外，菊黄东方鲀和暗纹东方鲀的染色体数目均为44条^[16]，表明这两种东方鲀发生杂交是完全可能的。

由于东方属鱼类物种分化时间较短^[17]，不易准确区分东方鲀属种之间的关系。利用与已公开发表的13种东方鲀属鱼类的线粒体基因COⅠ序列，不管利用最大似然法构建的进化树还是利用贝叶斯树，此15尾个体与菊黄东方鲀的点状和双斑东方鲀聚为一支，表明此15尾个体与此两种鱼类关系最为接近，然后依次为横纹东方鲀和暗纹东方鲀。为了进一步确定15尾个体的种属关系，我们利用两对内含子通用引物扩增了内含子序列，比较了核基因的内含子序列，表明此15尾个体混杂在菊黄东方鲀、暗纹东方鲀和双斑东方鲀之间。由于本实验室没有横纹东方鲀的样品，无法比较横纹东方鲀的相应内含子序列，鉴于依据COⅠ序列构建的系统关系树中，此15尾个体与横纹东方鲀也很接近，不排除此15尾个体也可能是横纹东方鲀和菊黄东方鲀、双斑东方鲀或暗纹东方鲀的杂交体。

其中10尾鱼(个体366、350、358、360、361、365、355、359、357和356)在体纹和各鳍鳍条数上，与菊黄东方鲀、双斑东方鲀、暗纹东方鲀和横纹东方鲀没有完全一致，体纹和鳍条数目介于此4种鱼之间，形成中间类型。此外，这10尾个体中，个体357和356的体纹和各鳍条数一致，个体366、358和365的体纹和各鳍条数一致，而其余5尾个体的体纹和各鳍条数没有完全相同的，结合此10尾个体在所依据COⅠ序列或EPIC所构建的系统关系树中的位置，可判断此10尾个体应为东方鲀属的杂交体，而不太可能是新种。至于这10尾个体是其中哪两种杂交，目前的证据很难确定。本研究所采集的样本直接来自东海区芦潮港渔民捕捞，这些杂交后代生活在东海海区，有可能是自然海区此4种东方鲀属鱼类的天然杂交体，如果是天然杂交，今后有必要调查其天然的产卵场。另外，由于目前有人工开展菊黄东方鲀和双斑东方鲀杂交的研究^[18]，不能排除这些杂交后代是人工杂交后代在养殖过程中逃逸或人工放流的结果。如果天然海区东方鲀属鱼类的杂交,是由于放流增殖规模的不断扩大或人工杂交种群的大量繁育逃逸的结果，则有可能导致天然水域东方鲀属鱼类的种质混杂，应需引起管理部门的重视。