鱼类的生长意味着蛋白质的合成和增加，最直观体现在体长和体质量的增加^[1]。鱼类的生长问题一直都是鱼类生理学研究的热点话题。同种鱼的不同个体生长速率与其摄食量大小有直接关系，生长较快的个体摄食量较大^{[2, 3, 4, 5]}。由于不同种类的摄食习性、食物组成和消化酶多样性，种间生长比较往往十分困难，因此，对不同种鱼生长差异机制的报道并不多。 鳜(Siniperca chuatsi)和斑鳜(S. scherzeri)是鳜鱼养殖的主要种类。它们摄食习性相同，但是生长差异明显。在人工养殖条件下，鳜达到商品规格需要6个月，斑鳜却需要大约2年时间^[6]。通过人工授精获得的杂交鳜(斑鳜♀×鳜♂)生长性状介于两亲本之间^[7]。由于它们都只以活饵为食^[8]，这为不同种类鳜鱼生长与摄食量间关系研究提供了基础与方便。胃蛋白酶(pepsin)是肉食性鱼类胃消化能力的重要参数。实验室前期已克隆了鳜^{[9, 10]}和斑鳜^{[11, 12]}3种胃蛋白酶原基因(PGA1、PGA2、PGC)cDNA全序列。原位杂交表明，鳜胃蛋白酶原、胃质子泵基因均在胃腺细胞中表达^[10]，PGA1、PGA2和PGC基因不同发育表达模式暗示它们在胃内消化作用中的特殊性^[6]。在前期工作的基础上，本研究目的是进一步探究不同种鳜鱼生长差异与其摄食量、胃蛋白酶活性和胃蛋白酶原基因表达间的内在联系，旨在通过摄食量和消化水平对鳜鱼种间生长差异进行分析和比较，为理解鱼类种间生长差异提供生理与分子基础。

幼鱼取自安徽省池州市秋浦特种水产开发有限公司，鳜、斑鳜、杂交鳜(斑鳜♀×鳜♂)为同批繁殖鱼，每种鱼120尾，体长5~6 cm。运回之后，分养在条件相同的3个循环水箱中，水箱大小是1.2 m×0.7 m× 0.5 m。水箱所使用的循环水是提前准备好的曝气水，并且加入适量的消菌液，水体温度保持在(27±1) ℃，pH为(7.4±0.3) ，水质较好。养殖期间，每天上午8:00和下午16:00喂食充足的饵料鱼，饵料鱼是规格相当的草鱼(Ctenopharyngodon idellus)苗，小于鳜鱼体长的1/3；每次的投喂量是160～180尾，定期清理粪残，每周换水一次，每次换水一半。实验的当天，早上8点投喂，下午6点进行实验，中间时间不投喂，随机选择6尾个体。冰上解剖，分别取全胃、肠道中段、幽门垂和部分肝脏，剔除组织附属物，4 ℃去离子水冲洗，滤纸吸干。将胃平均分成左右两半，一半用于测量胃蛋白酶比活力，另一半用于分析胃蛋白酶原基因的表达。、

3种鳜分养在3个水箱，每个水箱80尾，每隔10 d(0 d，10 d，20 d，30 d)测量一次，每次每种鱼随机捞取20尾，测量体长、体质量。然后按照如下公式，分别计算日均增重率和日均增长率：

摄食量参照AGUADO等^[13]方法，在每次生长实验的中间3天(第4天，第5天和第6天)连续进行，每天测量一次。上午投喂前，清理全部剩余饵料鱼，称重投喂饵料鱼，记为m₁；下午投喂前称重饵料鱼，记为m₂；第二天上午投喂前，捞起剩余饵料鱼并称重，记为m₃。日摄食量的计算公式为：

每种组织(胃、幽门垂、肠道、肝脏)称量0.1 g，加入1 mL预冷的去离子水(4 ℃)，用组织匀浆器打碎，冷冻离心机 8 000 r/min 离心10 min。收集上清液，即为酶液。酶液中胃蛋白酶浓度用BCA蛋白定量试剂盒(美国Thermo公司)测量，按说明书计算出胃蛋白酶的浓度，记为C。每个个体的酶液单独测量，最后计算平均值。 胃蛋白酶比活力的测定参照ANSON等^[14]的方法进行，用2%牛血红蛋白作为消化底物，用Tris-HCl调节反应液pH到2。酶标仪(Synergy H1 Bio-tek,美国)读出反应液在280 nm吸光值。胃蛋白酶比活力的计算公式为：

采用Trizol抽提法提取胃组织总RNA，琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，分光光度计测量RNA浓度。cDNA合成采用PrimeScript^RRT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒进行，取1 μg总RNA为模板，42 ℃条件下反应。反应液放入4℃冰箱里保存。根据鳜胃蛋白酶原基因(GenBank登录号为PGA1: EU807930.1,PGA2: FJ463155.1,PGC: EU807929.1)保守区序列设计，用Primer5软件分别设计特异性引物(表1)。β-actin基因(GenBank登录号：AY885683.1)用作内参基因。经标准曲线筛选之后，保证引物扩增效率在95%以上。荧光定量PCR采用SYBR Premix Ex Taq^TM试剂盒进行。反应体系是25 μL，反应条件为：95 ℃30 s预变性，95 ℃5 s，59.4~60.5 ℃ 30s，65 ℃ 10 s，40个循环，95 ℃ 5 min延伸。每个样品做3个重复，内参基因也做3个重复。PGA1、PGA2、PGC基因的相对表达量按2^-ΔΔCt方法计算^[21]。

表1(Table 1)

表1 鳜鱼胃蛋白酶原基因qPCR分析特异性引物和退火温度Tab. 1 Gene-specific primers of PGs and annealing temperature for qPCR analysis for Siniperca species 引物primer 序列(5′-3′)sequence (5′-3′) 退火温度annealing temperature 登录号accession number PGA1-F CCAGAACGGAGACTATGT 59.4 EU807930.1 PGA1-R GTATTGAGACTGACGGAC 59.4 EU807930.1 PGA2-F GAGAACCACAGGAGATTC 60.5 FJ463155.1 PGA2-R CCTCAACAGTGTCAATGG 60.5 FJ463155.1 PGC-F CTACGCTGATACCACCTA 59.4 EU807929.1 PGC-R GTTACAGTAGACGGAGTC 59.4 EU807929.1 act-F GCGTGACATCAAGGAGAA 59.4 AY885683.1 act-R CATACCGAGGAAGGAAGG 59.4 AY885683.1

表1 鳜鱼胃蛋白酶原基因qPCR分析特异性引物和退火温度 Table 1 Gene-specific primers of PGs and annealing temperature for qPCR analysis for Siniperca species

所有的实验数据都记为平均值±标准差 (SD)，所用软件为SPSS (Statistical Product and Service Solutions)10.0。多组对照的数据采用多因素进行显著性分析，显著性水平为P<0.05。数据作图均采用Sigma Plot 10.0 软件(Sigma-Plot^ 10.0,USA)。

实验起始，3种鳜鱼的平均体质量、体长差异不显著；实验后期，3种鱼的平均体质量、体长差异显著。鳜和杂交鳜体质量的日增加率分别是(1.171± 0.180) g/d和(1.019± 0.104) g/d，鳜和杂交鳜之间差异不显著，斑鳜的日增重率(0.433±0.078) g/d明显低于鳜与杂交鳜 (P<0.05，图1a)；鳜、杂交鳜和斑鳜体长的日增加率分别是(0.196±0.033) cm/d、(0.172±0.028) cm/d和(0.121±0.021) cm/d(图1b)。体重与体长结果一致表明，鳜生长最快，杂交鳜次之，斑鳜最慢。

图1(Fig.1)

图1 鳜、斑鳜和杂交鳜幼鱼体重(a)、体长(b)生长比较 Fig.1 rowth comparison of body weight and body length among S. chuatsi,S. scherzeri and their hybrid F1 不同的字母代表不同种鱼之间的差异显著性(P<0.05)，下同。 Different letters denote significant differences between different species (P < 0.05),the same in below.

鳜、斑鳜和杂交鳜日摄食量随鱼体生长不断增加，平均日摄食量为鳜(6.1±0.31) g/d，斑鳜(4.24±0.23) g/d，杂交鳜(5.26±0.33) g/d (图2)。实验初期，3种鳜鱼平均日摄食量差异不显著(P>0.05)，中、后期阶段，鳜与杂交鳜、斑鳜间差异显著。

图2(Fig.2)

图2 鳜、斑鳜和杂交鳜的平均日摄食量比较 Fig.2 Comparison of average amount of daily food intake among S. chuatsi,S. scherzeri and F1

在4种消化道组织中，胃蛋白酶比活力从高到低的顺序是：胃>幽门垂>肠>肝脏(图3)。结果显示，3种鳜鱼实验个体之间的胃蛋白酶比活力差异不显著(P>0.05)，种间差异较显著(P<0.05)。实验期间，3种鳜鱼胃中胃蛋白酶比活力都呈增加趋势。实验后期，鳜、斑鳜和杂交鳜胃中胃蛋白酶比活力分别是(347.8±13.3) U/g、(272.1±10.9) U/g和(303.4±12.1) U/g。鳜与杂交鳜、斑鳜间差异显著(P<0.05)。

图3(Fig.3)

图3 3种鳜鱼胃(a)、幽门垂(b)、肠(c)和肝脏(d)中胃蛋白酶比活力比较(n=6) Fig.3 Specific activity of pepsin in stomach(a),pyloric caeca(b),intestine(c) and liver(d) of S. chuatsi,S. scherzeri and F1 (n=6)

幽门垂中，鳜、斑鳜和杂交鳜胃蛋白酶比活 力分别是(157.1±5.2) U/g、(78.9±3.4) U/g和(93.3±3.7) U/g，鳜胃蛋白酶比活力最高，种间差异显著(P<0.05)。在肠道和肝脏也检测到了胃蛋白酶的比活力，但是，与胃和幽门盲囊的比活力相比，要低很多。

实验结果表明3种鳜鱼的种内个体之间的胃蛋白酶原基因表达量差异均不显著(P>0.05)。3种鳜鱼PGA1、PGA2和PGC的相对表达量均随生长阶段缓慢增加(图4)。PGC∶PGA1∶PGA2基因相对表达量比例是1.1∶1.0∶0.7。PGC与PGA1相对表达量间差异不显著，PGA2相对表达量明显较PGA1和PGC低(P<0.05)。相比之下，鳜3种基因(PGA1、PGA2和PGC)相对表达量均较杂交鳜、斑鳜高；3种鳜鱼基因表达量从高到低的顺序是：鳜>杂交鳜>斑鳜。实验后期，3种鱼基因相对表达量的差异较显著(P<0.05)。

图4(Fig.4)

图4 3种鳜鱼胃中胃蛋白酶原基因PGA1 (a),PGA2 (b),PGC (c)相对表达 Fig.4 mRNA expression of PGA1 (a),PGA2 (b),PGC (c) in stomach of S. chuatsi,S. scherzeri and F1

本研究中的3种鳜鱼为同批繁殖鱼苗培育而来。实验期间，饲养环境条件相同，鱼种放养密度一致，饵料鱼投放足量、适口，结果表明，3种鳜鱼体质量、体长的生长速率高低次序均为：鳜>杂交鳜>斑鳜。在野外或人工养殖条件下，鳜生长速率明显快于杂交鳜、斑鳜^[15]。因此，室内生长实验结果与野外实验结果一致，基本反映了不同鳜鱼种间生长快慢特征。

实验期间，3种鳜鱼的日摄食量间存在明显差异：鳜>杂交鳜>斑鳜。鱼类的日摄食量一般是由消化器官结构、摄食习性共同决定的。研究表明，鳜和斑鳜的口裂/体长比值差异不显著，且3种鳜鱼的胃重/体质量比也无明显差异^[16]；但在摄食节律方面，鳜摄食频率相对较高，斑鳜摄食频率较低^[17]。初步认为，不同鳜鱼日摄食量差异主要是由于摄食习性差异所致。鉴于3种鳜鱼的生长速率次序与其摄食量大小次序一致，推测不同鳜鱼的生长速率与其摄食量大小间存在正相关。这是因为食物摄取是鱼类生长发育的重要物质基础，摄食量大，同化作用较强，营养物质积累多，生长速率快；摄食量小，同化作用较弱，生长速率慢。这与同一种鱼不同品系生长速率的差异与其摄食水平间关联的结果相类似，如鲶(Silurus asotus)^[18]、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)^[19]，生长较快的品系一般摄食量大，而生长较慢的品系则摄食量较小。

胃是肉食性鱼类初始消化的主要器官，胃蛋白酶是食物蛋白质的主要消化酶。在选取的4种消化道组织中，胃蛋白酶比活力最高的部位是胃，这与前期对鳜主要消化酶的组织分布研究结果一致^{[20, 21]}。3种鳜鱼胃中胃蛋白酶比活力高低顺序是：鳜>杂交鳜>斑鳜。由于胃蛋白酶原分泌后需要胃酸激活，不同鳜鱼的胃酸分泌特征与激活途径尚不清楚。最近研究表明，鳜、杂交鳜胃粘膜层相对厚度较斑鳜厚，且胃酸酶原细胞密度也较斑鳜大，因此，鳜、杂交鳜胃蛋白酶的分泌水平可能高于斑鳜。另一方面，伴随摄入食物量增大，食物消化对消化酶(胃蛋白酶)需求也随之增加^[22]。与分泌水平相比，高活性的胃蛋白酶可以明显提高消化效率，完成食物消化的作用，促进胃排空。本研究中，3种鳜鱼取样时均保持胃排空的状态，测定胃蛋白酶比活力的温度和pH是相同的，这就使得3种鳜鱼的胃蛋白酶比活力具有可比性，且都是胃排空状态时的活力。鳜胃蛋白酶比活力高与其摄食量大、消化生理需求高间有一定关联，消化能力强也是摄食频率高形成的重要生理基础。

本研究中，幽门垂和肠道中也检测到了胃蛋白酶活性，由于前期研究未检测到胃蛋白酶原基因和质子泵基因的表达^{[7, 8, 9, 10, 11, 12]}，推测这些部位的胃蛋白酶可能来自胃腔的食物残渣，伴随胃排空，胃蛋白酶和食物残渣混合物进入幽门垂、肠道引起，而到了肠道，胃蛋白酶的活性要比幽门垂的胃蛋白酶活性还低。因此，幽门垂仍担负部分消化作用。肝脏中缺乏酸性环境，也检测到有胃蛋白酶活性，这些活性是在体外的酸性环境作用(激活胃蛋白酶原)后检测出来的，并非肝脏中直接分泌后激活形成。推测肝脏中的胃蛋白酶原不是用于食物消化，可能是维持肝脏中其他生理功能。DENG等^[11]在鳜鱼的肝脏中检测到胃蛋白酶原的表达，本文的研究更支持了肝脏中有未被激活的胃蛋白酶原，而胃蛋白酶原并不发挥消化的作用。

本实验中，3种鳜鱼胃中PGA1、PGA2和PGC相对表达量均随个体生长不断增加，这与其胃组织结构的发育过程一致。3种鳜鱼胃中PGA1、PGA2、PGC相对表达量高低次序为鳜>杂交鳜>斑鳜，这一次序和其胃蛋白酶比活力次序也是对应的。胃蛋白酶原基因表达量高低可直接影响胃蛋白酶原的合成水平。在其他鱼类中，也观察到胃蛋白酶原基因表达水平与胃蛋白酶活性同步变化的现象，如美洲拟鲽(Pseudopleuronectes americanus)^[23]、牙鲆(Paralichthys olivaceus)^[24]等。尽管目前尚难鉴定引起胃蛋白酶比活力增加的确切酶原类型，但胃蛋白酶原基因相对表达水平也可作为鳜鱼消化生理能力判别的一项重要指标。