条斑紫菜(Pyropia yezoensis)是我国、日本和韩国的主要栽培种,主要分布在我国的黄海、渤海、东海北部沿岸以及日本列岛和朝鲜半岛沿岸^[1]。条斑紫菜在分类上属于红藻门红毛菜科，是一种营养丰富的高蛋白、低脂肪食用海藻^[2]。紫菜的加工品主要为淡干紫菜饼、海苔等干制品，近几年随着紫菜产量的提高，紫菜加工也逐步向精深加工方向发展。多糖具有降血糖、抗凝血^[3]、抗肿瘤^{[4, 5]}、抗疲劳^[6]、抗辐射^[7]、抗氧化^{[8, 9]}、提高免疫力^{[2, 10]}等生理活性，已广泛应用于医药、食品、化妆品等领域。 自由基是机体氧化反应中产生的一类含有未配对电子基团、分子或原子的有害化合物^[11]，主要包括羟自由基、超氧阴离子等，是人体内的代谢产物，在正常情况下，处于动态平衡且浓度很低。当这一平衡被打破，就会对机体的组织和细胞造成损伤，进而引起慢性疾病及衰老效应，目前已经发现有100余类病症^[12]。抗氧化是多糖的重要应用领域之一，与其他外源性抗氧化剂相比，抗氧化多糖具有低毒、安全和来源广等特点^[13]，因此多糖作为天然抗氧化剂具有很高的开发价值。

近年来，多糖的研究逐渐引起人们的重视，多糖组成较为复杂，分子量可从几千到几十万，研究表明，多糖的生物活性与其相对分子量大小有关，相对分子量越大，体积越大，越不利于多糖跨越多重细胞膜障碍而进入生物体内发挥生物学活性，但分子量过低也无法形成产生活性的聚合结构^[13]。有关不同分子量条斑紫菜多糖抗氧化活性的研究几乎没有，因此本研究以条斑紫菜为原料，超滤膜分离法对条斑紫菜多糖提取液进行分离，研究不同分子量多糖对羟自由基(·OH)、超氧阴离子(·O₂^-)、DPPH·自由基的清除作用，评价紫菜多糖的抗氧化活性，以期为紫菜多糖的药理作用以及进一步提高紫菜的利用价值提供科学的参考依据。

条斑紫菜，购于江苏省大丰市。经烘干、粉碎、过筛后，备用。

主要试剂：DPPH(1,1-二苯基-2-苦基肼)为Sigma公司产品；浓硫酸；标准葡萄糖；三氯乙酸(TCA)；无水乙醇；重蒸酚；硫酸亚铁；水杨酸；三羟甲基氨基甲烷(Tris)、盐酸、双氧水、邻苯三酚等均为国产分析纯。

主要仪器及设备：UV/V-16/18型紫外可见光光度计(上海美谱达仪器有限公司)；电热鼓风干燥箱(上海讯博实业有限公司医疗设备厂)；数显恒温水浴锅(上海慧泰仪器制造有限公司)；H2050R台式高速冷冻离心机(湘仪离心机仪器有限公司)；空冷冻干燥机(德国Christ公司)；R206旋转蒸发仪 (上海申生科技有限公司)；循环水式多用真空泵(上海申生生物技术有限公司)；粉碎机(九阳股份有限公司)。

称取一定量的条斑紫菜粉末，按液料50∶1(mL/g)加入蒸馏水，100 ℃水浴保温2 h,减压抽滤后滤渣重复上述操作一次，合并两次多糖提取液，TCA除蛋白后分别透过分子截留量为100 000、50 000、10 000、5 000的超滤系统(Sartorius stedim,Vivafiow 200)，将多糖提取物按分子量大小分为MW≥100 000(PPⅠ)、50 000-100 000(PPⅡ)、10 000-50 000(PPⅢ)、5 000-10 000(PPⅣ)、MW≤5 000(PPⅤ)5部分。每部分分别在50 ℃下减压旋转蒸发浓缩至1/5体积，加入4倍体积无水乙醇沉淀多糖，置于4 ℃冰箱中静置过夜，析出的絮状物沉淀4 000 r/min离心15 min，收集沉淀物后真空冷冻干燥，得到不同分子量段的多糖样品。

多糖提取率Y(yield of polysaccharide)采用苯酚-硫酸法^[14]测定，以葡萄糖为标准物，在490 nm处分别测定PPⅠ、PPⅡ、PPⅢ、PPⅣ、PPⅤ多糖的含量。

式中：C为多糖提取液浓度(mg/mL)；N为稀释倍数；V为多糖提取液体积(mL)；W为干紫菜粉质量(mg)。

分别将5种分子量段多糖PPⅠ、PPⅡ、PPⅢ、PPⅣ、PPⅤ配制5个浓度梯度：2、4、6、8、10 mg/mL，进行试验。

用水杨酸法测定PP对羟自由基(·OH)的清除能力，参照YANG等的方法稍作改进^[15]。 配制好各试剂后，按表1依次加入各试剂，混匀，37 ℃水浴反应0.5 h后，蒸馏水调零，在波长510 nm下测定吸光度值，每个浓度平行测定3次，取其平均值，测定结果以清除率S_A(scavenging activity)表示。

式中：A₀为空白对照吸光度；A_X0样品本底吸光度；A_X为测定样品吸光度。

表1(Table 1)

表1 羟自由基(·OH)清除能力测定各管试剂配制Tab.1 Reagent preparation for scavenging activity of hydroxyl radical (·OH) mL 处理preparations 双蒸水double-distilled water 9 mmol/L硫酸亚铁ferrous sulfate 9 mmol/L水杨酸salicylic acid 样本samples 8.8 mmol/L过氧化氢hydrogen peroxide 空白对照管blank tube 1 1 1 0.2 样本对照管samples contrast 0.2 1 1 1 测定管measuring tube 1 1 1 0.2

表1 羟自由基(·OH)清除能力测定各管试剂配制 Tab.1 Reagent preparation for scavenging activity of hydroxyl radical (·OH) mL

对超氧阴离子(·O₂^-)清除能力的测定采用邻苯三酚自氧化法^[15]。配制好的各试剂按表2依次加入反应试管中，迅速混匀，在波长325 nm下测定吸光度值，从第1分钟开始读吸光度值，每隔30 s读一次。每个浓度组平行测定3次，取其平均值，以下式计算清除率S_A(scavenging activity)。

式中：△A₀为邻苯三酚自氧化速率。△A为加入样品后邻苯三酚的自氧化速率。单位均为吸光度值每分钟的增值。

表2(Table 2)

表2 超氧阴离子(·O2-)清除能力的测定各管试剂配制Tab.2 Reagent preparation for scavenging activity of superoxide anion (·O2-) mL 处理 preparations 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.2) 双蒸水double-distilled water 样本samples 10 mmol/L盐酸hydrochloric acid 45 mmol/L邻苯三酚pyrogallol 空白对照管blank tube 4.5 0.5 0.01 自氧化管autoxidation tube 4.5 0.5 0.01 测定管measuring tube 4.5 0.5 0.01

表2 超氧阴离子(·O2-)清除能力的测定各管试剂配制 Tab.2 Reagent preparation for scavenging activity of superoxide anion (·O2-) mL

参照JIA等^[16]的方法。分别取不同浓度的多糖样品溶液4 mL，加入1 mL用无水乙醇配制的DPPH溶液，并使DPPH终浓度为0.8 mmol/L。充分混匀后置于暗室中静置30 min，于517 nm波长处测定吸光度。按公式(2)计算DPPH·清除率S_A( scavenging activity)。

多糖提取液经过超滤膜分离后，不同分子量段PP占总糖比例见图1，分离出的PP中，PPⅠ占总多糖含量最高为32.44%，PPⅡ占18.57%，PPⅢ占15.68%，PPⅣ占14.58%，PPⅤ占18.73%。

图1(Fig.1)

图1 不同分子量段PP分布比例 Fig.1 Distribution ratios of PP with different molecular weight

从图2中可以看出，5种不同分子量的条斑紫菜多糖对羟自由基(·OH)的清除能力有所差异，但均表现出了清除能力，并且呈明显的剂量依赖关系。在多糖浓度为2 mg/mL时，PPⅤ就显示出较强的清除·OH的能力，其清除率达到15%以上；在浓度为4 mg/mL时，PPⅡ和PP Ⅲ对 ·OH清除作用明显增强，清除率均达到了18%以上，是PP Ⅰ的4.5倍左右；在浓度为10 mg/mL时，PPⅤ对·OH的清除率达到最大，为51.83%，说明相对分子质量较小的条斑紫菜多糖有较强的清除·OH作用。

图2(Fig.2)

图2 多糖对羟自由基(·OH)的清除作用 Fig.2 Scavenging effects of PP on hydroxyl radical (·OH)

超氧阴离子是生物体内第一个氧自由基，是其他活性氧的前体，能导致细胞死亡、酶失活、DNA和膜的降解，并能引起不饱和脂肪酸和其他易受影响物质的过氧化^[17]。因此，研究紫菜多糖对超氧阴离子的清除能力是研究其抗氧化活性的重要指标。不同分子量的条斑紫菜多糖对超氧阴离子的清除能力如图3所示，在实验浓度范围内，清除率随多糖浓度的增加而增大，PP Ⅴ和PP Ⅱ在浓度为6 mg/mL时，清除率达到53%以上，清除作用明显；PPⅣ在较高浓度(10 mg/mL)时清除作用最大为67.79%，是最小清除率PP Ⅲ的1.3倍 。

图3(Fig.3)

图3 多糖对超氧阴离子(·O2-)的清除作用 Fig.3 Scavenging effects of PP on superoxide anion(·O2-)

不同分子量多糖对DPPH·自由基清除活性的影响如图4所示，从图中可以看出5种不同相对分子质量的条斑紫菜多糖对DPPH·均有不同程度的清除作用，其清除能力均随多糖浓度的增大而增强，但当多糖浓度达到10 mg/mL时，清除率反而有所下降。PPⅤ对DPPH·的清除作用最强，其次为PPⅣ ，而PPⅢ和PPⅠ相对较弱，在浓度为8 mg/mL时，PPⅠ、PPⅡ、 PPⅢ、 PPⅣ和PPⅤ的清除率分别为27.18%、31.19%、30.09%、33.99%和38.45%。

图4(Fig.4)

图4 多糖对DPPH·自由基的清除作用 Fig.4 Scavenging effect of PP on DPPH free radical

从总体上观察(表3)，5种不同分子量的条斑紫菜多糖中，分子量较小的PPⅤ(MW ≤5 000)和分子量介于50 000～100 000的PPⅡ对羟自由基(·OH)和超氧阴离子(·O₂^-)具有较强的清除作用，PPⅤ和PPⅣ(MW:5 000～10 000)对DPPH·自由基的清除作用高于分子量较大的多糖。考虑将粗多糖PP用降解和超滤相结合的方法得到抗氧化活性较高的分子量段多糖，为高效利用条斑紫菜多糖寻找新的方法。

表3(Table 3)

表3 条斑紫菜多糖体外抗氧化能力顺序表Tab.3 The order of polysaccharides from Pyropia yezoensis in antioxidant properties 抗氧化指标antioxidant indicators 不同分子量条斑紫菜多糖抗氧化能力顺序 the order of polysaccharides from Pyropia yezoensis in antioxidant properties 羟自由基(·OH)hydroxyl radical PPⅤ＞PPⅡ＞PPⅢ＞PPⅣ＞PPⅠ 超氧阴离子(·O2-)superoxide anion PPⅤ＞PPⅡ＞PPⅣ＞PPⅠ＞PPⅢ DPPH·自由基DPPH free radical PPⅤ＞PPⅣ＞PPⅡ＞PPⅢ＞PPⅠ

表3 条斑紫菜多糖体外抗氧化能力顺序表 Tab.3 The order of polysaccharides from Pyropia yezoensis in antioxidant properties

本研究采用超滤膜法分离条斑紫菜多糖提取液，得到了良好的分离效果，可作为PP开发利用的一种新方法。体外抗氧化活性试验表明，不同分子量的PP都具有抗氧化能力，对羟自由基(·OH)、超氧阴离子(·O₂^-)、DPPH·自由基都具有较好的清除作用，自由基清除率均随多糖浓度的增加而增大，表现出量效关系。不同相对分子质量的多糖，在不同的抗氧化体系中，其抗氧化活性差异明显，PPⅤ和PPⅡ对羟自由基(·OH)和超氧阴离子(·O₂^-)具有较好的清除能力，PPⅤ和PPⅣ对DPPH·自由基的清除率高于PPⅡ、PPⅢ和PPⅠ。抗氧化能力与其相对分子质量大小相关，分子量较小的PPⅤ(MW ≤5 000)对羟自由基(·OH)、超氧阴离子(·O₂^-)和DPPH·自由基的清除作用均高于其他分子量段的多糖，抗氧化能力最佳。PPⅤ抗氧化活性最强，利用价值最大，但其所占总糖比例较少，只占PP组分的19％左右，PPⅠ占粗多糖比例虽高，但其活性较低，因此可考虑将活性较低的大分子PP用降解和超滤相结合的方法得到分子量合适的小分子多糖，为高效利用条斑紫菜多糖寻找新方法，也为开发高附加值条斑紫菜深加工产品奠定基础。