甲砜霉素(thiamphenicol，TAP)为第二代酰胺醇类抗生素，与氟苯尼考(florfenicol，FF)相比，其抗菌谱及抗菌效果都略低于氟苯尼考，但由于其物美价廉及对多种水产致病菌具有良好的抗菌效果、不易产生耐药性^[1]等特点，仍常被广泛应用于水产养殖动物细菌性疾病防控及治疗方面。

目前在水产养殖疾病治疗过程中，基于MIC的治疗浓度仅能阻止敏感菌的生长，却忽略了细菌耐药突变体的选择性富集^[2]。为了减少细菌耐药问题，1999年DONG和DRLICA等^{[3, 4]}提出防细菌耐药突变浓度(MPC)和耐药突变选择窗(MSW)的理论，MPC是防止耐药突变菌株被选择性富集扩增所需的最低抗菌药物浓度，MSW是最小抑菌浓度(MIC)和MPC之间的浓度范围。这一理论不仅着眼于治疗，更为有效抑制细菌耐药及制定抗菌药物用药策略提供了新思路。

随着氯霉素的禁用，现极有必要明确市面上两种酰胺醇类药物(TAP、FF)的治疗效果，并制定合理的给药方案。传统的抗菌药物药代/药效学(PK/PD)联合模型主要通过MIC与药时曲线下面积(AUC)等指标确定治疗方案，但仅能保证“控制感染”，如果养殖周期内反复使用同一种抗菌药，会导致抗菌药因致病菌产生耐药突变而失效。鉴于此本实验通过已有氟苯尼考^[5]相关研究，测定甲砜霉素对致病性嗜水气单胞菌(AH10)菌株^[6]的体外药效学参数及其在鲫体内的药代学参数，试图制定甲砜霉素控制鲫细菌性败血症的防突变用药方案，为制定临床用药方案提供理论指导。

主要仪器有：LC-100高效液相色谱仪(购自上海伍丰科学仪器有限公司)；旋转蒸发仪；精密电子天；高速冷冻离心机；旋转蒸发仪等。

色谱柱：ZORBAX-C₁₈分析柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：V(乙腈)∶V(醋酸钠水溶液)＝20∶80，pH=4.3；紫外检测器波长：224 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：20 μL。

主要药品：甲砜霉素标准品(≥99.1%)，购自中国兽医药品监察所；甲砜霉素原料药：(≥98.5%)，购于上海将来实业有限公司；MH液体;琼脂培养基。

主要试剂：乙腈、甲醇为色谱级；氨水、无水醋酸钠、冰醋酸、乙酸乙酯、正己烷为分析纯。以上药品均购于国药集团化学试剂有限公司。

健康的鲫购自上海崇明养殖场，体质量为150~200 g，于实验室水族箱(0.4 m×0.5 m×1.0 m)暂养一周后，将个体均匀的个体分为3组，每组120尾，试验期间水温(22±1)℃。

嗜水气单胞菌为实验室分离鉴定后保存的菌株，编号AH10。

配制甲砜霉素药物浓度为1 280 μg/mL^[7]，细菌菌液浓度为10⁶ CFU/mL，于30 ℃培养24 h后，以能抑制细菌生长的最小药物浓度为MIC。继续培养48 h，将MIC以上未见细菌生长的各试管，接种营养琼脂平板，计数少于5个菌落的最小药物浓度为最小杀菌浓度(MBC)。重复5次取平均值。

分别配制含药物浓度为2 MIC、4 MIC、6 MIC、8 MIC、10 MIC的药液肉汤琼脂平板，调整细菌菌液浓度达3×10¹⁰ CFU/mL，并吸取0.1 mL涂抹在上述含有不同药物浓度的琼脂平板上，使总接种量为1.2×10¹⁰ CFU，孵育72 h，没有菌落生长的最低药物浓度为MPC，重复5次取平均值；MSW为MIC与MPC之间的浓度范围^[8]。

设置试验组T₁、T₂、T₃药物浓度分别为2 MIC、4 MIC、8 MIC和对照组C₁、C₂分别为空白对照组和0.08 MIC药物残留对照组，于30 ℃孵育，使细菌与药物短暂接触1 h。采用400倍除药法，分别取上述试验组及对照管组中的混合液0.1 mL，加至30 ℃预温的1.9 mL的MH肉汤中，混匀后再取0.1 mL分别加至30 ℃预温的1.9 mL的MH肉汤中，并使C₂中加入甲砜霉素的浓度相当于被400倍稀释后的药物浓度，于30 ℃孵育，此时为去除药物后的零时。并在0、1、2、3、4、5、6、8 h进行细菌菌落计数，重复3次，取平均值^[9]。其中T、C分别为菌落数高于重建后零时10倍所需的时间，PAE按照公式：PAE=T-C计算。

甲砜霉素原料药按照20、30、40 mg/kg体重剂量口灌入鱼前肠，每组120尾，无回吐现象的留作试验。分别于给药后0.25、0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、24 h后取血液2 mL，肌肉样品2 g，血液于4 ℃静置8~12 h后离心取上清于-20 ℃保存，肌肉于-20 ℃保存。各时间点设置5个重复，给药前采取同一批试验鱼血液及肌肉空白样品。

取1 mL血清，并加入200 μL 25%氨溶液和无水硫酸钠0.2 g混匀1 min，再加入4 mL乙酸乙酯，水平震荡15 min，4 ℃条件下8 000 r/min离心10 min。再加入2 mL乙酸乙酯重复萃取一次，收集两次上清液，45 ℃恒温蒸发至干。加1 mL流动相溶解，8 000 r/min离心5 min，取上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤后，HPLC测定^[10]。

称取1 g肌肉，加入400 μL 25%氨溶液，混匀1 min，再加入5 mL乙酸乙酯和2 mL乙酸乙酯进行两次萃取，收集两次上清液，45 ℃恒温旋转蒸发至干。加入2 mL乙腈和3 mL正己烷，震荡2 min，静置10 min后，4 ℃条件下8 000 r/min离心5 min，取下层置45 ℃下蒸发至干。再加入1 mL流动相溶解，4 ℃条件下8 000 r/min离心5 min，取上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤后，HPLC测定^[10]。

称取0.06 g甲砜霉素标准品，用V(乙腈)∶V(三蒸水)= 20∶80，溶解于100 mL容量瓶中，此时甲砜霉素浓度为600 μg /mL。并稀释成20、10、5、1、0.5、0.05 μg /mL标准液，经0.22 μm滤膜过滤后HPLC分析。以峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标绘制标准曲线。

取100、10、1 μg/mL浓度的甲砜霉素各100 μL，加入到1mL的鲫空白血清中，按照1.5.2 方法进行处理，每个浓度3个平行，每个平行设1个空白对照，以测定相对回收率、日内及日间精密度。

标准曲线、药时曲线用Excel绘制，药代动力学模型及参数应用Kinetic 4.4 药代动力学软件处理。

甲砜霉素对AH10的MIC为1.0 μg/mL，MBC为2.0 μg/mL。表明甲砜霉素对嗜水气单胞菌具有较好的抗菌活性。防耐药突变浓度(MPC)为8.0 μg/mL，耐药突变选择窗(MSW)为1.0~8.0 μg/mL。表明甲砜霉素药物浓度在1.0~8.0 μg/mL时，可以达到治疗效果，但是不能防止耐药突变体的产生，只有当药物浓度高于8.0 μg/mL时，才能避免耐药性的产生。

将2、4、8 MIC浓度的甲砜霉素药液，与AH10菌液短暂接触1 h后，PAE结果分别为(1.30±0.13)h、(1.83±0.14)h、(2.1±0.12)h；除药后细菌生长曲线(图1)。结果发现在2~8 MIC范围内，PAE的时间随着药物浓度的升高而明显延长，表明甲砜霉素为浓度依赖性药物。

图 1(Fig.1)

图 1 甲砜霉素作用于嗜水气单胞菌后PAE期的细菌的生长曲线 Fig.1 The growth curve of Aeromonas hydrophila in the PAE of thiamphenicol

甲砜霉素标准液在0.05~20 μg/mL浓度范围内呈线性关系(图2)，其回归方程为y=42.4x -1.534 (r=0.999)。可见甲砜霉素线性关系良好。

图 2(Fig.2)

图 2 甲砜霉素标准曲线 Fig.2 Standard curve of thiamphenicol

按1.5.2样品处理方法操作后，测得鲫血清中甲砜霉素的平均回收率为83.58%，日内精密度为2.72%，日间精密度为2.96%，实验数据表明重现性较好，精密度较高。

按20、30、40 mg/kg体质量剂量口灌鲫甲砜霉素后，试验数据经Excel软件绘制药时曲线(图3)，结果显示单剂量口灌鲫甲砜霉素高浓度组比低浓度组达峰浓度升高，达峰时间提前。按20、30、40 mg/kg体剂量口灌甲砜霉素后，在第1、0.5、0.5 h血药浓度分别达到峰值(14.917±1.23)、(17.685±1.63)、(24.218±1.48) μg/mL；此后浓度下降，24 h浓度分别为(2.001±0.23)、(5.209±0.13)、(7.567±0.21) μg/mL。

图 3(Fig.3)

图 3 不同给药剂量下甲砜霉素在鲫血清中的药时曲线(n=5) Fig.3 The concentration time curve of thiamphenicol in serum of crucian carp at various doses(n=5)

口灌不同给药剂量，药时数据经Kinetica 4.4软件进行动力学模型拟合和参数计算。药动学参数见表1，相关药代学参数见表2。结果表明，3种口灌剂量条件下，鲫血清及肌肉内甲砜霉素药时数据均符合一级吸收二室模型。

表 1(Tab. 1)

表 1 鲫口灌不同剂量甲砜霉素后药动学方程Tab. 1 The concentration-time equations of thiamphenicol in crucian carp serum 剂量 dose 方程式 equation 20 mg/kg C=25.781e -0.7788t+3.190e -0.0225t－28.971e -1.686t 30 mg/kg C=13.549e -1.6972 t+10.274e -0.0333t－23.823e -7.403t 40 mg/kg C=16.638e -0.3933t+11.003e -0.0193t－27.641e -7.459t

表 1 鲫口灌不同剂量甲砜霉素后药动学方程 Tab. 1 The concentration-time equations of thiamphenicol in crucian carp serum

表 2(Tab. 2)

表 2 鲫血清中口灌不同剂量甲砜霉素药动学参数Tab. 2 The pharmacokinetic parameters of thiamphenicol in crucian carp serum 参数 parameters 给药剂量 dose 20 mg/kg 30 mg/kg 40 mg/kg A/(μg/mL) 25.781 13.549 16.638 α/h 0.7788 1.6972 0.3933 B/(μg/mL) 3.190 10.274 11.003 β/h 0.0225 0.0333 0.0193 Kel/(/h) 0.166 0.075 0.045 Ka/(/h) 1.686 7.403 7.459 T 1/2α/h 0.890 0.408 1.762 T 1/2β/h 30.800 27.813 35.880 T max/h 1.0 0.5 0.5 C max/(μg/mL) 14.917 17.685 24.218 MRT/h 35.928 31.684 48.211 AUC 24/[μg/(mL·h)] 89.539 174.560 251.682 AUC/[μg/(mL·h)] 89.539 174.560 251.682 CLs/[L/(kg·h)] 0.114 0.095 0.065 Vd/(L/kg) 5.084 2.847 3.384 注：A.分布相零时截距；α.分布速率常数；B.消除相零时截距；β.消除速率常数；Kel.药物在中央室的消除速率常数；Ka.吸收速率常数；T 1/2α.分布半衰期；T 1/2β.消除半衰期；T max.达峰时间；C max.达峰浓度； MRT.平均滞留时间；AUC 24.0-24 h内药时曲线下面积；AUC.药时曲线下总面积；CLs.总体清除率；Vd.表观分布容积。 Note: A. Intercept of the linear equation on log transformed data; α. Distribution rate constant; B.Slope of the linear equation on log transformed data; β. Elimination rate constant ; Kel. Elimination rate constant from the central compartment; Ka. Absorption rate constant; T 1/2α. Half-life of absorption from the central compartment; T 1/2β. Half-life of elimination; T max. Time required to reach C max in the interval; C max. Maximum concentration in the interval; MRT. Mean residue time of drug in body from 0 to 24 h;AUC 24.Area under the drug concentration-time curve from the time zero to twenty-four ; AUC. Area under the drug concentration-time curve from the time zero to last time point; CLs. Total body clearance; Vd. The apparent volume of distribution during the terminal phase.

表 2 鲫血清中口灌不同剂量甲砜霉素药动学参数 Tab. 2 The pharmacokinetic parameters of thiamphenicol in crucian carp serum

甲砜霉素是浓度依赖性药物^[1]，有研究指出AUC₂₄/MIC、C_max/MIC指标是浓度依赖性药物制定临床给药方案的重要参数^[11]。口灌不同剂量的甲砜霉素，鲫血清中的PK-PD联合参数及关系见表3、图4。结果发现，按20、30、40 mg/kg体质量剂量口灌甲砜霉素，在鲫血清中，AUC₂₄/MIC分别为89.539、174.560、251.682；C_max/MIC分别为14.92、17.69、24.22(表3)；血浆药物浓度大于MPC的维持时间分别为5、8、22 h(图4)。

表 3(Tab. 3)

表 3 PK-PD模型的相关参数Tab. 3 The parameters of PK-PD integration 剂量/(mg/kg)dose C max/MIC AUC 24/MIC MPC/(μg/mL) MSW/(μg/mL) 20 14.92 89.539 8.0 1.0～8.0 30 17.69 174.560 8.0 1.0～8.0 40 24.22 251.682 8.0 1.0～6.0

表 3 PK-PD模型的相关参数 Tab. 3 The parameters of PK-PD integration

图 4(Fig.4)

图 4 鲫血清中口灌不同剂量甲砜霉素在不同时间的药物浓度与MIC、MPC及MSW的关系图 Fig.4 Oral different dose of thiamphenicol in crucian carp serum at different time in drug concentration and MIC,MPC and MSW diagram

休药期的确定是临床制定给药方案的重要部分。中国和欧盟规定了甲砜霉素的最高残留限量(MRLs)为50 μg/kg。根据休药期的定义，仅根据可食用组织中残留的浓度来确定，因此本研究将肌肉组织作为残留检测组织，在给药剂量为40 mg/kg时，其药动学方程为C=15.969e^-0.2459t+3.064e^-0.0132t－19.033e^-0.2637t。在试验水温(22±1) ℃条件下，口灌40 mg/kg剂量药物后，鲫肌肉中甲砜霉素含量低于国家规定的最高残留限量(MRLs) 50 μg/kg的时间至少为15 d。

图 5(Fig.5)

图 5 40 mg/kg口灌剂量甲砜霉素在鲫肌肉中的药时曲线 Fig.5 Concentration-time curve of thiamphenicol in crucian carp muscle following oral 40 mg/kg

本实验药效学指标显示甲砜霉素对嗜水气单胞菌AH10具有较好的抗菌活性。相比氟苯尼考，其抗菌效果略低、MPC略高^[5]，因此在应用于临床控制感染时，这两种药物都能达到一定的治疗效果。水产养殖临床用药应选择有效的抗菌药物(低MPC、窄MSW)或者采取轮换使用药物的手段以避免耐药性的产生。目前国内外关于甲砜霉素药代学研究已有报道，如鲤鱼(Cyprinus carpio)^[12]、欧洲舌齿鲈(Dicentrarchus labrax L)^[13]等。本实验药代学特征显示，甲砜霉素在鲫体内吸收迅速、分布广泛、消除缓慢。其结果与杨洪波等^[1]、李静^[10]的报道结果一致。与鲈鱼(Lateolabrax japonicus)^[14]、凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)^[15]等动物体内甲砜霉素药代学参数相差较大，这可能与种属差异、给药剂量、环境等因素有关^[16]。因此在制定药物临床用药策略时，应综合考虑每种药物的抗菌谱及药物在不同种属体内的药代学差异，只有当PK/PD参数联合使用时，才能起到治疗效果。

传统给药方案主要依据药物体内药代学特征和体外最小抑菌浓度确定，并根据AUC₂₄/MIC、C_max/MIC和T>MIC指标判定药物活性和临床疗效。如杨洪波等^[1]制定了甲砜霉素防治松浦镜鲤细菌性败血症的给药剂量为8.52～47.94 mg/kg，PK-PD同步型参数AUC₂₄/MIC为35.37，C_max/MIC为24.89。这样的方法在大多数情况下是有效的，但是当血清或组织液药物浓度高于MIC且处于突变选择窗内时，会出现耐药突变菌株的选择性富集而使细菌耐药^[2]。为解决这一问题，临床实践中应通过选择低MPC、窄MSW的药物，或通过调整剂量方案使治疗量高于MPC的浓度，并结合动物体内药物-血液浓度变化特征，制定更加合理的用药方案。

徐丽娟等^[17]和王浩等^[18]应用MPC、MSW理论与药物体内药代学特征相结合的模型，建立了恩诺沙星控制鲫细菌性败血症的用药方案。基于以上MSW理论的治疗策略，本实验制定了甲砜霉素控制鲫细菌性败血症防耐药突变用药方案。高延玲等^[19]指出，浓度依赖性药物在AUC₂₄/MIC>125或C_max/MIC>10情况下可以起到理想的治疗效果。结果发现，在鲫体内，口灌30、40 mg/kg体重剂量的药物都能达到AUC₂₄/MIC>125、C_max/MIC>10的要求；但血药浓度大于MPC的维持时间分别为8 h、22 h。为了在控制感染的同时可以限制耐药菌的产生，应保证血药浓度大于MPC的维持时间在(24-PAE)h以上，因此确定最佳给药剂量为40 mg/kg，且浓度依赖性药物应每日一次给药^[17]。由此可知，在试验水温(22±1) ℃条件下，甲砜霉素治疗鲫细菌性疾病的给药剂量为40 mg/kg，一日一次，休药期至少为15 d。