水葫芦(Eichhornia crassipes)又名凤眼莲，原产于南美洲，是雨久花科多年生水生植物。1901年作为花卉引入我国^[1]，之后在长江流域及其以南地区呈泛滥之势^[2]，因此，很多学者都在研究水葫芦资源化利用的可能。当前，水质净化方面水葫芦已成为生态修复工程中应用较广的水生植物^[3]。到目前为止，在太湖^[4]、滇池^[5]等水体中进行的规模化种植水葫芦来净化水质已经取得了一些成果。本实验室近年来也在进行利用水葫芦净化水产养殖水体的研究，结果表明其在营养物质移除方面具有较好的效果。然而，对于水产养殖系统而言，作为一种外源性的生物植入，水葫芦的种植势必对水体的生物群落结构造成影响，了解这样的影响有利于从生物多样性的角度来判断水葫芦是否适合在养殖池塘中进行栽培，也可以进一步丰富人们对于浮床植物影响水体浮游细菌群落结构的认识。

已有研究表明，水葫芦根际分泌物可以通过使藻类叶绿素a破坏、光合作用速率降低等方式产生克藻效应^[6]，从而可以影响在水产养殖系统中具有重要作用的藻类的群落结构；对于金黄色葡萄球菌、藤黄八叠球菌、枯草杆菌和假单胞菌等异养菌的影响实验表明^[7]，水葫芦根际分泌物对几种细菌的影响不一，既可能是抑菌作用(金黄色葡萄球菌)，也可能是增殖作用(藤黄八叠球菌)或不产生任何影响(枯草杆菌和假单胞菌)。由此可见，水葫芦种植对于整个细菌群落的影响可能会因种植之前水体细菌群落的不同而不同；而在富营养化湖泊水体种养水葫芦实验的研究结果表明^[8]，水葫芦种植区可以提高水体可培养细菌的多样性，改变细菌群落结构。到目前为止，水葫芦种植对水产养殖水体细菌群落结构影响的研究还未见报道。

高通量测序技术相对于传统测序技术来讲，是里程碑式的进步^[9]，主要表现在其极大地加快了测序速度，并且显著降低了测序成本。对于微生物群落多样性研究来说，PCR-DGGE^[10]、PCR-TGGE^[11]、PCR-SSCP^[12]、PCR-RFLP^[13]、PCR-ARDRA^[14]等分子生物学技术相对于传统的基于培养的方法已经表现出明显的优势，但和高通量测序技术相比，这些技术对环境中微生物信息的发掘还不够全面^[15]，主要表现在对多态性检测的分辨率上，高通量测序技术能够得到更多的操作分类单元(OTU)。本文希望采用高通量测序技术，在更高的检测分辨率下研究水葫芦净化池塘的细菌群落结构，以期为相关研究提供参考。

矩形试验池塘位于中国水产科学研究院淡水渔业研究中心南区，约60 m长(东北-西南方向)，35 m宽(西北-东南方向)，初始水深约1.5 m，采样时水深约为2 m左右。2013年5月8日投放平均体重约为100 g的吉富品系尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)鱼种约3 500尾。每天投喂一次(15:30左右)。2013年6月7日，10~15 cm高的水葫芦苗种到70个2 m长、1.5 m宽的矩形浮床中，每个浮床内水葫芦苗漂浮面积占浮床面积10%左右。浮床框架为直径50 mm的PVC管，孔径为2 mm×2 mm的尼龙网系到PVC管上形成网兜状，水葫芦苗漂浮于其中。至采样时，每个浮床内的水葫芦几乎占满整个浮床。所有浮床组成的矩形种植区域在池塘中的布局如图1所示。2013年7月7日上午进行水样采集，采样点同样如图1所示，于距离种植浮床区边缘50 cm处采集50 cm深水样，采样点a1、a2、a3水样混合为wp1,采样点b1、b2、b3水样混合为wp2，在与种植区相对应的敞水区设置采样点，采样点位置大致与种植区对称，A1、A2、A3水样混合为w1，B1、B2、B3水样混合为w2。250 mL水样经孔径0.22 μm微孔滤膜过滤，滤膜放置2 mL灭菌离心管后浸于液氮罐中短暂处理，然后放于-80 ℃超低温冰箱中备用。

图 1(Fig. 1)

图 1 采样点布设示意图 Fig. 1 Sampling stations in the intensive pond

采用DIONEX ICS3000型离子色谱仪测定水样中硝酸盐氮(NO₃-N)和亚硝酸盐氮(NO₂-N)；纳氏试剂分光光度法测定水样中氨态氮(NH₃-N)浓度；总有机碳分析仪(GE SieversInnovOx Laboratory TOC Analyzer)测定水样TOC及总碳(TC)、无机碳(IC)浓度；过硫酸钾氧化法测定总磷(TP)和总氮(TN)。

根据PowerWater DNA Isolation Kit(MO BIO,美国)的要求，取出保存备用的滤膜，按照试剂盒说明书提供的操作步骤进行DNA的抽提，利用Mobio PowerClean^®DNA Clean-Up Kit进行DNA的纯化，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测纯化后的基因组DNA。

合成带有barcode(标签)的特异引物，扩增16S rRNA基因V1~V3可变区；引物序列为27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，533R: 5′-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3′；采用ABI GeneAmp^®9700型基因扩增仪进行PCR扩增。 全部样品按照正式实验条件进行，每个样品3个重复，将同一样品的PCR产物混合后用2%琼脂糖凝胶电泳检测，使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)切胶回收PCR产物，Tris_HCL洗脱； 2%琼脂糖电泳检测。参照电泳初步定量结果，将PCR产物用QuantiFluor^TM -ST蓝色荧光定量系统(Promega公司)进行检测定量，之后按照每个样品的测序量要求，进行相应比例的混合。

将产物连接“Y”字形接头，使用磁珠筛选去除接头自连片段，利用PCR扩增进行文库模板的富集，采用氢氧化钠变性后得到单链DNA片段。应用高通量测序平台Illumina MiSeq进行高通量测序，具体过程如下：DNA片段的一端与引物碱基互补，固定在芯片上；另一端随机与附近的另外一个引物互补，也被固定住，形成“桥 (bridge)”；PCR扩增，产生DNA簇；DNA扩增子线性化成为单链；加入改造过的DNA聚合酶和带有4种荧光标记的dNTP，每次循环只合成一个碱基；用激光扫描反应板表面，读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种类；将“荧光基团”和“终止基团”化学切割，恢复3′端粘性，继续聚合第二个核苷酸； 统计每轮收集到的荧光信号结果，获知模板DNA片段的序列，以上工作由上海美吉生物医药科技有限公司协助完成。

对测序结果进行详细的生物信息学分析之前先对数据进行去杂优化。根据PE Reads之间的重叠关系，使用Seqprep(https://github.com/jstjohn/SeqPrep)软件将成对的Reads拼接成一条序列。根据标签序列区分各个样品的测序数据。数据去杂方法和参数如下：(1)根据PE reads之间的重叠关系，将成对reads拼接成一条序列，最小重叠长度为15 bp；(2)拼接序列的重叠区允许的最大错配比率为0.02，最小错配率为0.9，筛选不符合序列；(3)检测序列末端box序列，最小错配数为0将起始端包含box的序列进行反向互补，并去除box；(4)检测序列上的标签并区分样品，标签错配数为0，最大引物错配数为2。

采用Qiime(http://qiime.org)在相似度97%水平下对优化序列进行OTU(operational taxonomic unit)聚类分析和分类学分析；样品的稀释性曲线分析、菌群丰度指数分析(Chao 1 指数 (http://www.mothur.org/wiki/chao)和ACE 指数(http://www.mothur.org/wiki/Ace))、菌群多样性指数分析(Shannon指数 (http://www.mothur.org/wiki/Shannon)和Simpson指数(http://www.mothur.org/wiki/Simpson) 均采用Mothur软件。采用Canoco4.5软件环境变量和生物变量间的冗余分析(RDA)。

通过对4个样品的高通量测序分析，得到145 525条优化序列(Reads)，36 210个OTUs(Operational Taxonomic Units),这些OTUs可以归纳为36个门(phyla)或组(groups)。通过稀释性曲线分析(图2)可以看出，水葫芦种植区水样和敞水区水样具有明显的差别，前者的曲线更趋向于平坦，表明对敞水区来说测序深度还可以更深。

图 2(Fig. 2)

图 2 相似度97%时的稀释性曲线图 Fig. 2 Rarefaction curves of OTUs clustered at 97% sequence identity across different area of the pond

通过对“门”水平的群落组成进行分析，表明蓝细菌门(Cyanobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、绿菌门(Chlorobi)浮霉菌门(Planctomycetes)、梭杆菌门(Fusobacteria)是水葫芦栽培池塘主要的浮游细菌组成(图3)。其中蓝细菌门处于绝对优势地位，其次是变形菌门和放线菌门。同时敞水区水样(图3a、b)和水葫芦种植区水样(图3c、d)的细菌群落组成在门水平上有变化，主要表现在水葫芦种植区水样蓝细菌门的相对丰度增加而绝大多数其他门类的相对丰度下降,敞水区水样蓝细菌平均相对丰度为49.6%，而水葫芦种植区蓝细菌的平均相对丰度为79.9%；变形菌门和放线菌门在所有样品中的相对丰度仅低于蓝细菌门，两者的平均丰度分别从敞水区水样中的20.1%和11.8%下降到水葫芦种植区的9.1%和3.8%。表明水葫芦种植区水葫芦的存在使得该水域中细菌群落更倾向于以蓝细菌为主。

图 3(Fig. 3)

图 3 池塘中浮游细菌的群落组成 Fig. 3 Bacterial compositions of the different communities

在“纲”水平继续分析敞水区和水葫芦种植区的细菌群落组成，结果表明(图4)，蓝细菌门中的主要组成是蓝细菌纲，其在水葫芦种植区水样和敞水区水样中的平均相对丰度分别为47.5%和78.6%；变形菌门中主要由α变形菌纲、β变形菌纲、γ变形菌纲和δ变形菌纲组成，四者在敞水区水样和水葫芦种植区水样中的总平均相对丰度分别为18.95%和8.97%，分别占变形菌门的94.3%和76.0%。但是在敞水区和水葫芦种植区水样间这4者的相对比例存在着较显著的差异，在敞水区以β变形菌纲为主(α变形菌纲、β变形菌纲、γ变形菌纲和δ变形菌纲的平均相对丰度分别为4.11%、10.75%、2.69%和1.40%)，在水葫芦种植区则γ变形菌纲的相对丰度显著增加(相对应四者的平均相对丰度分别为1.58%、2.92%、3.93%和0.54%)；放线菌门中的主要组成是放线菌纲，其在敞水区和水葫芦种植区水样中的平均相对丰度分别为8.42%和2.84%，分别占放线菌门的71.4%和74.7%。

图 4(Fig. 4)

图 4 “纲”水平群落组成柱状图 Fig. 4 Microbial community barplot in class level

图6中红色显示了一些“属”在敞水区和水葫芦种植区水样之间丰度差别也比较大，聚球藻属(Synechococcus)、蓝细菌属(Cyanobacterium)、泛菌属(Pantoea)、海氏菌属(Hirschia)、Massilia、Crocinitomix、玫瑰螺菌属(Roseospirillum)、Filimonas在敞水区水样中的丰度高于水葫芦种植区，水栖菌属(Enhydrobacter)和不动菌属(Acinetobacter)在水葫芦种植区水样中的相对丰度高于敞水区水样。

图 6(Fig. 6)

图 6 分层聚类热图 Fig. 6 Microbial community heatmap analysis

为了进一步研究敞水区和水葫芦种植区水中细菌群落的分布情况，笔者对敞水区水样和水葫芦种植区水样共有OTUs和Reads进行分析，结果如表1所示，蓝细菌门(Cyanobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、绿菌门(Chlorobi)浮霉菌门(Planctomycetes)和梭杆菌门(Fusobacteria)7个门中的共有OTUs(占所有共有OTUs 95.4%)占总OTUs(36210)的比例仅为9.68%,然而，这部分共有OTUs所对应的相对丰度却分别占敞水区水样(wm)和水葫芦种植区水样(wp)的51.34%和75.37%，表明敞水区和水葫芦种植区水样中差异性细菌群落具有更大的多样性，而这些共有OTUs在水葫芦种植区占有更大相对丰度的现象可能预示着水葫芦种植区细菌群落多样性下降的事实。具体到各自的门类，小的共有OTUs比重对应更大的相对丰度的顺序(OR/AR)分别是敞水区：绿菌门(Chlorobi)、浮霉菌门(Planctomycetes)、变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)、蓝细菌门(Cyanobacteria)和梭杆菌门(Fusobacteria)；水葫芦种植区：绿菌门(Chlorobi)、变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、浮霉菌门(Planctomycetes)、放线菌门(Actinobacteria)、蓝细菌门(Cyanobacteria)和梭杆菌门(Fusobacteria)。表明敞水区和水葫芦种植区水样中差异性细菌群落具有更大的多样性的现象在绿菌门(Chlorobi)、浮霉菌门(Planctomycetes)、变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)中更为突出。其中，敞水区水样和水葫芦种植区水样相比，这一比例在变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)中产生了较大的变化，均是敞水区高于水葫芦种植区。表明水葫芦种植使得变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)中细菌群落多样性可能均发生了显著的变化。

表 1(Tab.1)

表 1 主要细菌门类中共有OTUs和共有Reads比例Tab.1 The ratios of the common OTUs and reads to their total in seven main phyla % 类 别 taxa 共有OTUs占该门类总OTUs的比重 ratios of the common OTUs to their total(OR) 共有Reads占对应水样中该门类总Reads的比重(AR) ratios of the common reads to their total wm wp Cyanobacteria 15.55 65.59 82.99 Proteobacteria 6.32 32.39 45.68 Actinobacteria 11.19 50.91 64.88 Fusobacteria 13.69 54.88 65.54 Bacteroidetes 6.28 31.27 45.00 Planctomycetes 9.69 54.79 67.61 Chlorobi 6.62 60.22 72.47

表 1 主要细菌门类中共有OTUs和共有Reads比例 Tab.1 The ratios of the common OTUs and reads to their total in seven main phyla

通过对样品多样性(Shannon指数、Simpson指数)、丰富度指数(Ace指数和Chao指数)的研究显示(表2)，与敞水区相比，水葫芦种植区的Shannon指数下降，Simpson指数上升，表明水葫芦种植区的菌群多样性低于敞水区；同样水葫芦种植区的Ace指数和Chao指数显著低于敞水区，表明该区域菌群丰富度指数显著低于敞水区；另外，比较这次测序所得到的Reads和OTUs同样表明，敞水区水样得到了更多的Reads和OTUs，可能从另一方面佐证两个区域菌群多样性、丰富度的差别。

表 2(Tab.2)

表 2 样品多样性和丰度指数Tab.2 Richness and diversity statistics of the samples 样品名 samples Reads OTUs 相似度97%下的多样性及丰富度指数 values of richness and diversity index under the similarity of 97% Ace Chao Shannon Simpson wm1 34031 13598 105995(103687,108281) 50747(48409,53241) 8.03(8,8.05) 0.0073(0.0069,0.0077) wm2 32934 15507 136273(133384,139233) 65000(62031,68158) 8.44(8.41,8.46) 0.0032(0.003,0.0034) wp1 58671 10760 64520(63043,66039) 33603(31997,35330) 5.65(5.62,5.68) 0.1386(0.1357,0.1414) wp2 19889 5324 39964(38696,41279) 19318(17916,20877) 5.64(5.59,5.69) 0.1285(0.1238,0.1332)

表 2 样品多样性和丰度指数 Tab.2 Richness and diversity statistics of the samples

所有群落组成及分布、丰富度及多样性上的差别又可以在“属”水平的分层聚类热图分析中得到进一步的体现(图6)。图6表明，丰度较高的属(图6中上部黄色、红色的区域)不仅包括蓝细菌门中的属[微囊蓝细菌属(Microcystis)、 聚球菌属(Synechococcus)、蓝细菌属(Cyanobacterium)、Cylindrospermosis]和变形菌门中的属[气单胞菌属(Aeromonas)、多核杆菌属(Polynucleobacter)、球衣细胞属(Sphaerotilus)、水栖菌属(Enhydrobacter)、不动菌属(Acinetobacter)，还包括厚壁菌门(Firmicutes)中的属 (Cetobacterium)]等其他门类。这些在属水平上,甚至在种水平上的组成和丰度差异使得水葫芦种植区水样(wp1和wp2)和敞水区水样(wm1和wm2)被归为两类，这进一步表明了两者多样性、丰富度上的差别。

图5显示了水葫芦净化池塘中氨态氮(NH₃-N)、硝态氮(NO₃-N)、亚硝态氮(NO₂-N)、总磷(TP)、总氮(TN)、叶绿素a(Chl.a)、总有机碳(TOC)、总碳(TC)、无机碳(IC)等环境因子与多样性指数(Shannon指数和Simpson指数)和丰富度指数(Chao指数和Ace指数)之间的关系。图5表明水葫芦净化池塘中叶绿素a和NO₂-N与水体细菌多样性和丰富度均呈负相关，其他指标与水体细菌多样性和丰富度均呈正相关。其中TN与细菌多样性之间具有更大的相关性，NO₃-N与细菌多样性和丰富度均具有比较大的相关性，TC、TOC、IC和NH₃-N与细菌丰富度之间具有更大的相关性。由于Simpson指数值越低所反映的多样性越高,所以其与Chl.a和NO₂-N呈正相关与Shannon指数与这两个指标呈负相关是对应的。

图 5(Fig. 5)

图 5 部分环境变量和多样性、丰富度指数间的冗余分析图 Fig. 5 Redundancy analysis of some environmental variables with diversity and abundance index

当前，为了解决池塘养殖过程中出现的病害、水产品质量安全和面源污染隐患等问题，很多学者把精力放在池塘微生态环境的认知和调控方法的研究上^[16]。对于池塘水体中细菌群落的认知是其中重要的一部分，因为池塘中的细菌群落与池塘中营养物质循环、水质状况、养殖生物的健康状况等均具有重要的关系^[17]。

已有研究表明，不同的养殖品种对水体细菌群落组成具有显著的影响。如WU等^[18]的研究表明，草鱼养殖池塘水中居于前两位的优势菌群是变形菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)；CHENG等^[19]对于中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)养殖池塘水体中细菌群落的研究表明，疣微菌门(Verrucomicrobia)为优势菌群；而本研究表明，罗非鱼精养池塘中敞水区最主要的浮游细菌组成是蓝细菌门(Cyanobacteria)和变形菌门(Proteobacteria)。罗非鱼精养池塘的细菌群落组成有其自身的特点，这应该与不同养殖品种的生活习性、食性特征、饵料差别等有关。相对于草鱼和中华绒螯蟹来说，吉富罗非鱼投饵量大，残饵和粪便产生量多，由此造成的过多的营养物质输入可能是造成蓝细菌门相对丰度较大的主要原因。本文主要是以罗非鱼养殖池塘为研究对象，研究浮床种植水葫芦对浮游细菌群落结构的影响，因此，其结果是基于池塘罗非鱼养殖这一前提的，在总体上应该表现出了罗非鱼养殖池塘的部分特点(特别是在敞水区)。但是敞水区和种植区间群落结构和多样性的差别表明了浮床种植水葫芦对浮游细菌群落结构和多样性能够产生影响。

通过本次调查发现，水葫芦种植使得种植区附近浮游细菌的群落结构和敞水区间显著不同。首先，水葫芦种植区蓝细菌门(Cyanobacteria)的相对丰度上升，这与预期的由于化感作用使得蓝细菌丰度下降的结果是相反的。其他一些浮床试验如采用浮床栽培旱伞草(Cyperus alternifolius)^{[20, 21]}，由美人蕉和水雍菜组成的复合浮床^[22]，由香姑草(Hydrocotylevulgaris ) 、浮叶植物睡莲( Nymphaea tetragona ) 和沉水植物轮叶狐尾藻( Myriophyllum verticillatum) 组成的梯级浮床^[23]等表明，浮床栽培这些水生植物可以使得蓝细菌门的种群生物量下降，表明了水葫芦分泌的化感物质对蓝细菌门来说效果可能并不明显，其克藻效应可能对一些真核藻类更有效果，亦或是由于在养殖池塘中更容易产生浮床对藻类的吸附与拦截作用^[24]，具体还有待进一步研究。

其次，和敞水区相比，水葫芦种植区细菌群落多样性和丰富度都下降。如前所述，水葫芦种植区和敞水区细菌群落多样性的变化在蓝细菌门(Cyanobacteria)并不显著，更大的变化发生在变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)。表明对于敞水区蓝细菌门丰度上升的原因是由于浮床的吸附与拦截作用可能性更大一点。对于多样性和丰富度的变化可能与蓝细菌及其他藻类在浮床区的聚集有关。总体上来讲，浮床种植水葫芦使得该区域浮游细菌群落多样性下降，蓝细菌聚集，因此，抛开其可以带走水体氮磷等营养物质能力的因素，单从对水体浮游细菌生物多样性的角度来说，水葫芦可能并不是最好的选择。

最后，浮床种植水葫芦对池塘中浮游细菌造成影响的机理可能是多方面的，而通过一定程度上对环境因子的改变来施加影响应该是其中的机理之一。基于此，本文对其进行了探讨。但是，由于采样点不多和采样次数的限制，所得到的结果可能只是大体上表明了主要环境因子与细菌群落多样性、丰富度之间的关系，这样的关系中比较明显的趋势应该具有参考意义。其中，环境因子NO₂-N和Chl.a与细菌多样性和丰富度呈负相关可能与NO₂-N和与Chl.a相关的藻毒素对大量浮游细菌的毒性有关；由于水葫芦的种植使得该区域蓝细菌聚集，蓝细菌的相对丰度上升，因而水体Chl.a浓度上升，而由于藻体释放的藻毒素等有毒物质对其他浮游细菌的毒性作用，使得该区域浮游细菌多样性下降；对于NO₂-N来说，有研究表明，其通常在池塘中与Chl.a的相关性并不显著^[25]，因此，其与细菌多样性之间呈现的关系可能与水葫芦种植所造成的其他一些因素改变有关，具体还有待进一步研究。

本研究采用了基于Illumina MiSeq平台的高通量测序技术来分析浮游细菌的群落结构，得到了36 210个操作分类单元(OTUs)，最少的样品中也得到了19 889个OTUs，这是由于高通量测序技术可以检测出丰度极小的一些细菌种类，这一点是许多其他分子生态学技术所办不到的，通过其他手段得到的OTUs通常只有几十个^{[26, 27, 28, 29]}，因此通过对这些OTUs的分析能得到更为丰富的多样性、丰富度信息，同时还能够对一些丰度较小的类别进行分析，如本研究中在“属”水平的分层聚类图中我们可以看到敞水区和水葫芦种植区之间在一些相对丰度较小的属间的一些差异，为我们提供了更为细微的信息。结合先进的生物信息学的分析方法，使得庞大的数据量转化为适用的、更为丰富的微生物信息。

(1)浮床栽培水葫芦的罗非鱼精养池塘水体中处于优势地位的浮游细菌群落为蓝细菌门、放线菌门和变形菌门。 (2)水葫芦种植使得养殖池塘水体中浮游细菌群落的空间分布产生变化。种植区蓝细菌门的相对丰度增加，绝大多数的其他门类相对丰度下降；表现在群落多样性和丰富度上面，种植区浮游细菌群落多样性和丰富度均下降；在所有门类中，水葫芦种植使得变形菌门和拟杆菌门的多样性变化最大。 (3)从生物多样性的角度来说，池塘种植水葫芦可能不是好的选择。 (4)浮床栽培水葫芦的罗非鱼精养池塘水体中，NO₂-N和Chl.a与浮游细菌群落多样性和丰富度呈负相关关系。