卤虫幼体和成虫均含有丰富的营养物质，是鱼类和甲壳类及其幼体的优质饵料^{[1, 2]}，但在营养方面存在缺陷，可通过营养强化提高卤虫的营养价值^[3]。常用的卤虫营养强化原料包括微藻、鱼油、脂质体等^[4]。

由于水生动物特殊的代谢特性，投喂1 kg饲料可以产生162 g养殖固体废弃物^[5]。循环水养殖系统中可以收集养殖固体废物进行厌氧消化产甲烷、堆肥或者作为养殖用水反硝化碳源^{[6, 7]}。生物絮凝技术通过刺激异养细菌优势生长，同化利用氨氮，形成可被水生动物摄食的微生物絮团，可将养殖水体中的氨氮升级为微生物蛋白，实现养殖废弃物中氮的二次利用和养殖水体的原位控制^[8]。目前生物絮凝技术已经成功应用于罗非鱼和对虾的养成等^[9]。针对卤虫非选择性滤食的特点，将残饵粪便培养形成的生物絮凝体作为卤虫幼体的饵料来源，既有利于摄食卤虫的水产动物幼体的生长，又能够避免残饵粪便中的营养物质直接排入水中造成的浪费及水质污染^{[10, 11]}。因此，本实验将生物絮凝技术应用于水产养殖领域中卤虫的营养强化，既能为卤虫营养强化寻找廉价的原料，也可实现水产养殖固体废弃物的资源化利用。

卤虫卵来自于美国旧金山大盐湖。生物絮体由上海海洋大学循环水养殖系统中心实验室利用水产养殖固体废弃物培养所得。水质测试所用药品均为分析纯，来自国药集团化学试剂有限公司。

残饵和粪便取自养殖高体革(Scortum barcoo)的循环养殖系统的沙滤缸。

实验用5个悬浮式生物反应器作为生产生物絮凝体的装置。反应器为有机玻璃材质、桶状，有效体积为10 L，高为 100.0 cm，内径15.0 cm，外径15.8 cm。用1台135 W、曝气量为100 L/min的空气压缩泵(ACO-008，森森有限公司，浙江，中国)分装5个沸石曝气头(每个反应器一个)以提供溶解氧和混合强度。

残饵粪便在进入SBR反应器之前先进行预处理。取5个500 mL 的锥形瓶，每个锥形瓶中放入25 g残饵粪便、200 mL自来水连续曝气72 h。将曝气后的悬浊液完全转入洁净的 SBR 反应器，加水至10 L，放入曝气石用电磁式空气泵曝气，采取连续曝气方式以提供有氧环境。培养过程中，附着在悬浮式生物反应器壁上的生物絮体，采用手动刷洗的方式定期去除。每日需向反应器中加一定水量，以补充曝气导致的蒸发失水及实验检测失水。不定期添加葡萄糖，使水体中溶解有机碳与氨氮的比值(DOC/TAN)保持15以上^[12]。培养40 d后，测得絮体粗蛋白含量为28.52%±1.72%，粗纤维含量为 5.73%±0.49%，粗灰分含量为 11.62%±2.08%。开始投喂卤虫。

从序批式生物絮凝反应器中取出培养成熟的生物絮体悬浮液，定容到1 L，测得TSS为344.7 mg/L。加入海水晶，将盐度调节为30左右，并加入1 mL微量元素浓缩液(表1)，pH调节为7左右^[11]。

取1 L超纯水，加入海水晶，将盐度调节为30左右，并加入1 mL微量元素浓缩液(表1)，pH调节为7左右，配制为人工海水备用。

表1(Tab. 1)

表1 微量元素浓缩液Tab. 1 The concentrate solution of microelement MgSO4·7H2O ZnSO4·7H2O CaCl2·2H2O MnCl2·4H2O CoCl2·6H2O (NH4)6Mo7O24·4H2O FeSO4·7H2O CuSO4·7H2O 超纯水ultra-pure water 10 g 2.2 g 7.3 g 2.5 g 0.5 g 0.5 g 5 g 0.2 g 1 L

表1 微量元素浓缩液 Tab. 1 The concentrate solution of microelement

取10个容量为1 L的烧杯作为卤虫孵化器，将卤虫孵化器用300 mg/L高锰酸钾溶液浸泡5 min，用海水冲洗干净。将孵化器分为2组，每组5个平行。孵化器中的条件设计见表2。

表2(Tab. 2)

表2 实验条件设计Tab. 2 The design of experiments 组号group number 人工海水/Lartificial seawater 生物絮凝体悬浮液/Lbio- floc suspension TAN/(mg/L)total Ammonia NO2-N/(mg/L)nitrite NO3-N/(mg/L)nitrate 温度/℃temperature pH 溶解氧/(mg/L)DO 1 0 1 2.96 0.66 7.03 24.97 7.78 7.50 2 1 0 2.62 0.68 6.17 24.47 7.86 7.39

表2 实验条件设计 Tab. 2 The design of experiments

每升水放3 g卤虫卵，连续曝气24 h。24 h 后减少充气量。每天取样进行显微镜观察。

水质pH、溶解氧(DO)、温度(T)、盐度(SAL)等参数使用YSI多参数水质测量仪(YSI Incorporated 1725,Yellow Springs,美国)测定。TAN，NO₃^--N和NO₂^--N，总氮(TN)以《水和废水监测分析方法》第四版为参考^[13]。

总脂的提取参照FOLCH等^[14]的方法，脂肪酸分析采用毛细管气相色谱法^[15]。所用气相色谱仪为HP6890A型气相色谱，毛细管柱为30.0 m×0.32 mm×0.25 μm(温度上限为325 ℃)的HP-5.5%Phenyl Methyl Siloxane，载气为高纯度氮，流量为1.9 mL/min，氢气流量为30 mL/min，空气流量为300 mL/min，型号为Agilent19091J-413。

图1为生物絮凝体强化组和人工海水孵化组中卤虫的存活率。由图1可知，生物絮凝体强化组第1天的存活率为61%±1%，第5天的存活率为70%±2%；而人工海水孵化组第1天的存活率为57%±1%，第5天的存活率为52%±1%。在第1天，两组的存活率相差不大，在第5天，生物絮凝体强化组的卤虫存活率大于人工海水孵化组。

图1(Fig.1)

图1 不同实验组中卤虫的存活率 第1组为生物絮凝体强化组，第2组为人工海水孵化组。 Group 1:The artificial seawater; Group 2: The bioflocs group. Fig.1 The survival rates of artemia in different experiment groups

图2为生物絮凝体强化组和人工海水孵化组中卤虫的体长。在第1天和第2天，生物絮凝体强化组的卤虫体长略高于人工海水孵化组的卤虫。而第3和第4天，则是人工海水孵化组的卤虫体长略高于生物絮凝体强化组的卤虫。第五天，生物絮凝体强化组的卤虫体长达到(953.41±55.64) μm，人工海水孵化组的卤虫体长达到(916.31±73.43) μm。生物絮凝体强化组的卤虫体长高于人工海水孵化组的卤虫。

图2(Fig.2)

图2 孵化过程中不同实验组卤虫的体长变化 Fig.2 The variation of body length during hatch

由图版可见，培养的生物絮凝体呈淡黄褐色，形状开放不规则，结构非常松散，粒径为10～400 μm之间，这与AZIM和LITTLE^[16]的研究结果描述相似。人工海水组内水体无较多其他物质可被卤虫摄食，而生物絮凝体悬浊液组中，则含有丰富的絮凝体等可供卤虫幼体摄食。通过显微镜观察，看到第5天人工海水孵化的卤虫肠道内容物较少，而生物絮凝体悬浮液强化的卤虫肠道内容物较多。表明卤虫可以摄食絮体或悬浊液中内容物。

表3为生物絮凝体和分别用生物絮凝体悬浊液与人工海水强化的卤虫的脂肪酸含量。由表3可知，卤虫脂肪酸组成主要包括饱和脂肪酸C16∶0、单不饱和脂肪酸16∶1n9、18∶1n9、18∶1n5和多不饱和脂肪酸EPA。生物絮凝体中检测出17种脂肪酸 ，而生物絮凝体悬浊液强化的卤虫与人工海水强化的卤虫分别检测出13种和12种脂肪酸。生物絮凝体的脂肪酸种类相对比较丰富，说明生物絮凝体的营养价值较高。强化的两组卤虫体内，五种必需脂肪酸十八碳二烯酸18∶2n6、十八碳三烯酸18∶3n6、二十碳四烯酸(ARA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)^[17]的含量均为经过生物絮凝体悬浊液强化组高于人工海水孵化组,可见生物絮凝体对卤虫的强化起到了一定的作用。一般情况下，EPA和DHA对养殖对象幼体的生长影响较大，加入生物絮凝体悬浮液的实验组中，卤虫体内EPA和DHA含量较高，分别达到12.00%和1.72%。可见，生物絮体悬浮液可以强化卤虫营养。

表3(Tab. 3)

表3 生物絮凝体和卤虫中的脂肪酸含量Tab. 3 The fatty acid content of the bio-flocs and artemia % 脂肪酸fatty acid 第1组1st group 第2组 2nd group 生物絮凝体bio-floc 14∶0 1.27±0.23 1.57±1.04 4.18±1.22 15∶0 0 0.63±0.08 1.31±0.27 16∶0 12.13±1.09 10.28±2.58 22.76±2.55 16∶1n9 10.06±0.31 15.69±3.16 4.93±0.98 16∶1n7 0 0 0.71±0.59 16∶1n5 0 0 0.85±0.02 17∶0 1.09±0.77 0.94±0.05 0 18∶0 7.35±2.03 6.75±1.29 5.77±1.74 18∶1n9 12.14±1.19 12.00±3.82 9.46±3.18 18∶1n5 17.16±0.57 0 3.86±1.07 18∶2n6 3.85±0.03 3.81±0.94 12.35±2.23 18∶3n6 1.78±1.72 1.50±0.71 1.14±0.72 19∶0 12.13±2.06 14.03±3.24 10.19±0.90 20∶1n9 0 0 1.58±1.02 20∶4n6(ARA) 3.84±0.50 0 3.94±0.56 20∶5n3(EPA) 12.00±1.28 11.56±2.96 5.55±1.28 22∶1n11 0 0 1.11±0.06 22∶6n3(DHA) 1.72±0.07 1.03±0.47 10.32±2.74 注：第1组为生物絮凝体强化组；第2组为人工海水孵化组。 Note:Gropu 1.The artificial seawater； Group 2.The bioflocs group.

表3 生物絮凝体和卤虫中的脂肪酸含量 Tab. 3 The fatty acid content of the bio-flocs and artemia

生物絮凝体是由微生物、藻类、原生动物及其他碎屑、有机颗粒组成的，含有丰富的营养物质及不饱和脂肪酸EPA、DHA及PHB等^[18]。在水产养殖生产中应用生物絮凝技术 (Bio-flocs Technology，BFT)，可以将养殖过程中产生的固体颗粒物转化为可被部分养殖对象重新摄食的絮体饵料，解决养殖过程中的水质净化问题，并实现蛋白质的重复利用^[19]。絮体的粒径在1 μm到数千μm之间，而卤虫是无选择性滤食的浮游动物，可以滤食粒径为1～50 μm之间的颗粒物。因此，卤虫可以摄食部分生物絮凝体，利用生物絮凝体悬浊液营养强化卤虫是可行的。本实验中，通过显微镜观察，在第5天生物絮凝体悬浮液强化的卤虫肠道内容物比人工海水孵化的卤虫肠道内容物明显增多。表明卤虫可以摄食絮体或悬浊液中内容物。实验结果为卤虫在第5天存活率为69.70%，表明卤虫在生物絮凝体环境中可以生存。廖永岩等^[20]研究发现，在一定范围内，卤虫存活率、体长和体重均随饵料密度的增加而逐渐增加，本实验中，人工海水水体中可供卤虫摄食的颗粒物较少，而生物絮凝体悬浊液中含有大量粒径在1 μm到数千μm之间的颗粒物，可认为生物絮凝体组的饵料密度比人工海水组的饵料密度大，因而生物絮凝体组的卤虫存活率应比人工海水组的卤虫存活率高，本实验结果为，生物絮凝体强化组的卤虫存活率在第1天和第5天均大于人工海水孵化组，在第5天生物絮凝体强化组的卤虫体长高于人工海水孵化组的卤虫，与廖永岩等^[20]的研究吻合。但在实践中，水体中悬浮颗粒和溶解性有机物的量过多会影响卤虫的摄食。本实验中，生絮凝体悬浊液的总固体悬浮颗粒物浓度(TSS)为344.7 mg/L，此浓度对卤虫的生长是否有影响仍需进一步研究。此外，絮体是一个无时不在变化的结构，在絮体的形成和降解过程中，水体中的氨氮等浓度会发生较大变化，对水质影响较为严重，对卤虫的生长会产生一定的影响，探究影响卤虫存活率的因子，絮体TSS浓度可作为一个影响因子进行研究。且絮体具有絮凝作用，而卤虫初孵无节幼体个体小，游泳能力弱，在强化过程中需注意避免絮体对卤虫幼体造成絮凝致死现象。在卤虫营养强化过程中，维持卤虫较高的存活率是保证经济效益的直接方法。本实验中，生物絮凝体强化组卤虫在第五天存活率为69.70%，是否有卤虫幼体产生絮凝致死现象仍需进一步探讨。

图版(Plate)

图版 卤虫和生物絮凝体的显微镜图 Plate The optical micrographs of artemias and Biological flocculation 1.生物絮凝体悬浮液组； 2.人工海水组； 3、4.生物絮凝体。 1.Artemia with Bioflocs group; 2. Artemia with artificial sea water; 3，4. Biological flocculation.

卤虫的营养强化是利用其非选择性滤食的特点，将粒径适口的颗粒状物质包裹于卤虫消化道内，水产动物通过捕食卤虫而间接地将被包裹颗粒物摄入体内，达到输送营养物质的目的^[21]。其基本原理是卤虫饵料的营养组成及含量会影响卤虫体内营养的组成及含量^[15]。脂类是水产动物必需的营养物质之一，脂肪酸的组成会影响其生长速度、存活率和应激抵抗能力。卤虫无节幼体体内多不饱和脂肪酸的缺乏，是影响卤虫营养价值和实际应用的重要因素^[22]。因此，营养强化要使卤虫体内脂肪酸，尤其是多不饱和脂肪酸的种类和含量增加。

本实验中，生物絮凝体的5种必需脂肪酸十八碳二烯酸18∶2n6、十八碳三烯酸18∶3n6、二十碳四烯酸(ARA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)含量均较高，经生物絮凝体悬浊液强化的卤虫体内这5种必需脂肪酸的含量均比人工海水孵化组的卤虫高。表明生物絮凝体能够营养强化卤虫。EPA和DHA是其中最为重要的不饱和脂肪酸，同时是水产动物生长和发育必需的脂肪酸，多数水产动物幼体缺乏C∶20及以上的碳链延长酶，不能合成EPA、DHA等不饱和脂肪酸，需要从饵料中获得，其含量高低直接影响营养价值，因此卤虫体内EPA和DHA的含量优劣一定程度上决定了其营养价值^[23]。本实验中，加入生物絮凝体悬浮液的实验组中卤虫体内EPA和DHA含量较高，分别达到12.00%和1.72%，均高于人工海水孵化的卤虫。表明生物絮凝体悬浮液可以强化卤虫营养。但是，生物絮凝体内DHA的含量为10.32%，而强化后的卤虫体内DHA含量仅为1.72%，比人工海水孵化组的卤虫体内DHA含量仅高0.69%，强化效果并不明显。因此，寻求更高的营养强化效果的强化方法是接下来应该研究的方向之一。