2015, Vol. 160
2. 中国水产科学研究院黄海水产研究所 农业部海洋渔业可持续发展重点实验室, 山东 青岛 266071
近年来，迅速发展的对虾养殖业已成为我国水产养殖业的支柱产业。2012年我国对虾类养殖总产量为160.8万吨，其中凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)产量为145.3万吨；中国明对虾(Fenneorpenaeus chinensis)产量为4.12万吨(中国渔业统计年鉴，2013)，为社会创造了显著的经济效益和社会效益。然而，暴发性的流行性疾病给对虾养殖业造成严重的经济损失[1]。细菌病和病毒病是影响对虾产业最主要的病害问题，受到越来越多的重视[2, 3]。李继秋等[4]研究了对虾在感染病毒后肠道内细菌的数量及组成变化情况，指出感染WSSV的对虾肠道细菌总数显著高于未感染WSSV的对虾，感染WSSV的对虾肠道内的气单胞菌属显著高于未感染WSSV的对虾。对虾肠道是一个复杂的微生态系统，具有消化吸收营养和防御疾病双重功能[5]。DEMPSEY[6]等对虾类的消化道细菌群落进行分离鉴定，发现好氧菌的菌群主要为弧菌属、产碱菌属、气单胞菌属、发光杆菌属和假单胞菌属。有作者报道自对虾体内存在的细菌中筛选益生菌，能够提高对虾对疾病的防御能力[7, 8, 9]。本文通过调查分析不同养殖场的对虾肠道内菌群结构和携带病毒之间的关系。以期为运用微生物生态调控方法防治对虾疾病技术的建立提供基础数据。
1 材料与方法 1.1 样品的采集样品采集时间为2013年7-10月，样品包括凡纳滨对虾和中国明对虾，采样地包括我国山东、江苏及韩国，将采集到的活虾放入氧气袋中运回实验室，共采集样品8批次。
1.2 样品的处理用75%的酒精擦拭活虾体表进行消毒，无菌条件下活体解剖，取出其完整肠道。将取出的肠道组织用无菌的PBS(pH=7.4)缓冲液冲洗3～4次后放入1.5 mL的无菌EP管中称重，分别往无菌EP管加入1 mL的PBS缓冲液，用无菌研磨棒研磨均匀，用10倍递增稀释法制成菌悬液。
1.3 优势菌株的分离纯化取0.1 mL的各稀释度菌悬液，采用需氧平板菌落计数法分别涂布于2216E固体培养基的平板上，每个梯度3个平行，倒置于28 ℃恒温培养箱中培养16～20 h。观察2216E平板上细菌的菌落形态，在菌落数为30～300的平板上对菌落颜色、形态、大小一致的菌株进行编号及计数，并将活菌数的数量排列在前2位的菌株判断为优势菌株，记录优势菌株数量并进行划线，纯化至获得纯培养菌株。将纯培养菌株接种于2216E海水液体培养基内，在转速为150 r/min，28 ℃振荡培养箱中培养16～20 h进行扩大培养待鉴定用。
1.4 优势菌株的16S rDNA序列分析 1.4.1 PCR模板制备用移液器吸取培养16～20 h的菌悬液1 mL放入无菌1.5 mL的EP管中，12 000 r/min离心2 min，除去上清液，再加入1 mL的RNase-free水，充分吹打混匀，沸水浴10 min，12 000 r/min 离心10 min，取上清液(DNA悬液)作为PCR扩增的模板。
1.4.2 引物与PCR扩增以提取的细菌基因组DNA为模板，用细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增，引物由上海生物工程公司合成。扩增引物序列为[10]：
正向引物序列5′-AGAGTTTGATCCTGGCT CAG-3′；
反向引物序列5′-GGTTACCTTGTTACGAC TT-3′。
PCR扩增体系：25 μL含模板DNA 1 μL，正向引物、反向引物各1 μL，Premix Ex Taq 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性5 min； 94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35个循环； 72 ℃延伸10 min。PCR产物片段长度约为1 400 bp，对PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。检测后有目的条带的样品，送往上海桑尼生物科技有限公司进行测序。
1.4.3 16S rDNA序列分析测序结果在Ezbiocloud中利用BLAST软件http://ezgenome.ezbiocloud.net/ezg_BLAST网站上进行同源性比较，找出其所属的种类范畴，并且选取相似性最高的序列。
1.5 病毒检测白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)的检测采用世界动物卫生组织(OIE)水生动物健康诊断手册推荐使用的WSD nest-PCR检测方法[11]。两轮PCR扩增产物电泳后均未出现阳性条带的病毒检测结果判定为WSSV阴性结果；第一轮PCR扩增产物电泳未出现阳性条带，第二轮PCR扩增产物电泳出现阳性条带，判定为WSSV阳性结果；两轮PCR扩增产物电泳后均出现阳性条带的判为WSSV强阳性结果。
2 结果凡纳滨对虾肠道内可培养细菌总数、优势菌种类及占可培养细菌总数的百分比，以及病毒检测结果见表1，从表中结果可以看出：各批次凡纳滨对虾肠道内可培养细菌总数在1.26×106至1.09×109 CFU/g之间，弧菌属(Vibrio sp.)在6批次凡纳滨对虾肠道内均占有较高比例，占可培养细菌总数的20.80%～89.42%。其他优势菌属主要包括：乳球菌属(Lactococcus sp.)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、葡萄球菌属(Staphylococcus sp.)、希瓦氏菌属(Shewanella sp.)、节杆菌属(Arthrobacter sp.)、发光杆菌属(Photobacterium sp.)、微小杆菌属(Microbacterium sp.)。 6批样品中有一批样品没有检测WSSV，剩余5批样品检测WSSV，结果显示有1批次是WSSV阴性，2批次样品WSSV强阳性，2批样品WSSV阳性。检测出WSSV强阳性的凡纳滨对虾肠道内的优势菌属有希瓦氏菌属、弧菌属、发光杆菌属，分别占可培养细菌总数的21.67%～34.21%、31%～33.49%、21.03%～66.83%。
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表1 凡纳滨对虾肠道内可培养细菌数量、优势菌属及WSSV检测结果 Tab. 1 The quantity of cultivable bacteria,the composition of dominant bacteria general and WSSV in the intestinal tract of the Litopenaeus vannamei |
中国明对虾肠道内的可培养细菌总数、优势菌种类及占可培养细菌总数的百分比，以及病毒检测结果见表2。从表中结果可以看出：各批次中国明对虾肠道内的可培养细菌总数在2.47×108～1.09×109 CFU/g，2批次中国明对虾病毒检测结果均显示WSSV阳性，肠道内的优势菌属均为弧菌属和发光杆菌属，分别占可培养细菌总数的64.37%～71.52%和28.14%～34.13%。
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表2 中国明对虾肠道内可培养细菌数量、优势菌属及WSSV检测结果 Tab. 2 The quantity of cultivable bacteria,the composition of dominant bacteria general and WSSV in the intestinal tract of the Fenneorpenaeus chinensis |
凡纳滨对虾肠道内的优势菌属总数、优势菌株种类、数量及占该优势菌属总数的百分比，以及病毒检测结果见表3。从表3可以看出：第1批次凡纳滨对虾肠道优势菌属乳球菌属的菌株组成为格氏乳球菌(L. garvieae)，占乳球菌属总数的100%，弧菌属主要由魔鬼弧菌(V. diabolicus)和哈维氏弧菌(V. harveyi)组成，分别占弧菌属总数的84.33%和15.67%。第2批次凡纳滨对虾肠道优势菌属弧菌属由副溶血弧菌(V. parahaemolytics)和溶藻弧菌(V. alginolyticus)组成，分别占弧菌属总数的56.86%、30.68%，芽孢杆菌属由蜡样芽孢杆菌(B. cereus)组成，占该菌属总数的100%。第3批次凡纳滨对虾肠道优势菌属弧菌属由施氏弧菌(V. shilonii )和溶藻弧菌组成，分别占该菌属总数的67.22%和29.58%，葡萄球菌属由表皮葡萄球菌(S. epidermidis)和溶血葡萄球菌(S. haemolyticus)组成，分别占该菌属总数的62.95%和37.05%。第4批次凡纳滨对虾肠道优势菌属希瓦氏菌属由S. amazonensis组成，占该菌属总数的100%，弧菌属由溶珊瑚弧菌(V. coralliilyticus)、副溶血弧菌组成，占该菌属总数的80.33%和19.67%，发光杆菌属由美人鱼发光杆菌(P. damselae)组成，占该菌属总数的100%，节杆菌属由阿氏节杆菌(A. arilaitensis)组成，占该菌属总数的100%。第5批次凡纳滨对虾肠道优势菌属发光杆菌属由美人鱼发光杆菌组成，占该菌属总数的100%，弧菌属由巴西弧菌 (V. brasiliensis) 组成，占该菌属总数的100%，希瓦氏菌属由S. amazonensis组成，占该菌属总数的100%。第6批次凡纳滨对虾肠道优势菌属弧菌属由哈维氏弧菌和副溶血弧菌组成，占该菌属总数的80.87%和19.13%，微小杆菌属由深海微小杆菌(Exiguobacterium profundum)组成，占该菌属总数的100%。
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表3 凡纳滨对虾肠道内可培养优势菌属数量和优势菌种组成 Tab. 3 The quantity of dominant bacteria general and the composition of dominant bacteria in the intestinal tract of Litopenaeus vannamei |
中国明对虾肠道内的优势菌属总数、优势菌株种类、数量及该优势菌属总数的百分比，以及病毒检测结果见表4。从表4可以看出:第7批次中国明对虾肠道内优势菌属弧菌属由副溶血弧菌组成，占该菌属总数的100%，发光杆菌属由美人鱼发光杆菌组成，占该菌属总数的100%。第8批次中国明对虾肠道内优势菌属弧菌属由哈维氏弧菌组成，占该菌属总数的100%，发光杆菌属由美人鱼发光杆菌组成，占该菌属总数的100%。
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表4 中国明对虾肠道内可培养优势菌属数量和优势菌种组成 Tab. 4 The quantity of dominant bacteria general and the composition of dominant bacteria in the intestinal tract of Fenneorpenaeus chinensis |
综合表1和表2的结果表明，各批次凡纳滨对虾和中国明对虾肠道内的可培养细菌总数、优势菌菌群组成以及数量在每个采样地点都有所不同，可培养细菌总数在105至109 CFU/g之间，优势菌属呈现种属类别少、个别菌属分布多的特征，弧菌属占可培养细菌总数的20.80%～93.58%，是所有对虾肠道内最高比例的优势菌属。凡纳滨对虾和中国明对虾均有样品检测为WSSV阳性，检测出WSSV阳性对虾肠道的优势菌属为弧菌属、希瓦氏菌属、发光杆菌属。6批WSSV阳性对虾样品中均检测到弧菌属细菌，占可培养细菌比例为33%～93.58%。4批WSSV阳性对虾样品中检测到希瓦氏菌属细菌，占可培养细菌比例为21.67%～34.21%。2批WSSV阳性对虾样品中检测到发光杆菌属细菌，占可培养细菌比例为21.03%～66.83%。
综合表3和表4的结果表明，各批次凡纳滨对虾和中国明对虾肠道内的优势菌属的菌株组成以及数量在每个采样地点都有所不同，1批次凡纳滨对虾没有检测WSSV，该批次对虾肠道优势菌属乳球菌属的菌株组成为格氏乳球菌，弧菌属主要由魔鬼弧菌和哈维氏弧菌组成。2批次WSSV阳性凡纳滨对虾肠道优势菌属弧菌属由副溶血弧菌、溶藻弧菌和哈维氏弧菌组成，芽孢杆菌属由蜡样芽孢杆菌组成，微小杆菌属由深海微小杆菌组成。2批次WSSV强阳性凡纳滨对虾肠道优势菌属希瓦氏菌属由Shewanella amazonensis组成，弧菌属由溶珊瑚弧菌、副溶血弧菌、巴西弧菌组成，发光杆菌属由美人鱼发光杆菌组成，节杆菌属由阿氏节杆菌组成。1批次WSSV阴性凡纳滨对虾肠道优势菌属弧菌属由施氏弧菌和溶藻弧菌组成，葡萄球菌属由表皮葡萄球菌和溶血葡萄球菌组成。2批次中国明对虾均为WSSV阳性，中国明对虾肠道内优势菌属弧菌属由副溶血弧菌和哈维氏弧菌组成，发光杆菌属由美人鱼发光杆菌组成。
3 讨论通过本次调查研究发现凡纳滨对虾和中国明对虾肠道内的优势菌属的菌株组成以及数量在每个采样地点都有所不同，且菌属分布不均匀，呈现细菌种属类别少个别菌属分布多的特征。弧菌属为明显的优势菌属，所占的优势菌占总菌数的百分比为20.80%～93.58%。这可能是受养殖环境、不同养殖场的养殖模式不同的影响。WANG等[12]研究发现中国明对虾成虾消化道内的优势菌为弧菌属和假单胞菌属，且在前肠、中肠和后肠中的细菌数量分别为1.3×105、2.8×105、1.1×104 cfu/尾。宛立等[13]对健康的凡纳滨对虾肠道的好氧菌进行研究，共分离得到111株菌，分别属于13个属，发光杆菌属、弧菌属、气单胞菌属、肠杆菌属、黄单胞菌属(Xanthomonas sp.)为优势菌。以上资料表明，在不同条件下，尽管对虾肠道的主要菌群有所差异，弧菌属、气单胞菌属(Vibrio sp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)以及发光杆菌属为对虾消化道中常见的优势菌。
WSSV是世界范围内对虾病毒性疾病的主要病原，分布广泛，危害严重，感染WSSV后可引起对虾大规模死亡[3, 14]。本次调查研究的对虾样品中除一次没有进行病毒检测外，其他7批次样品只有1批未检出WSSV。6批WSSV阳性对虾样品中均检测到弧菌属，4批WSSV阳性对虾样品中检测到希瓦氏菌属，2批WSSV阳性对虾样品中检测到发光杆菌属。未感染WSSV对虾样品肠道内可培养细菌总数为2.18×109 cfu/g，感染WSSV对虾样品肠道内可培养细菌总数为1.26×106～1.59×109 cfu/g，感染WSSV后引起对虾肠道菌群变化不尽相同，是由于对虾肠道微生物区系受到肠道内在结构和外在因素双重影响[15, 16, 17]。
在健康的对虾肠道细菌群落中，一般是1到2个属的优势菌占主要地位，OXLEY等[18]指出无论是野生的还是养殖的墨吉对虾，在健康的对虾肠道中弧菌属为优势菌群。YASUDA等[19]发现在日本对虾的幼体期弧菌属是优势菌属。弧菌是对虾体内存在的正常菌群，一般为优势菌，但一些弧菌是条件致病菌，当宿主免疫力下降或其数量超过正常值时可引起对虾发生疾病，如：烂鳃病、红腿病、甲壳溃疡病和烂尾病等[20, 21, 22]，SKJERMO和VADSTEIN[23]证实条件性致病菌的大量繁殖是水产动物发生疾病的主要原因,其造成疾病发生的可能性往往要大于专性病原菌。WIPASIRI等[24]采用浸浴法，用哈维氏弧菌感染黑虎虾，实验结果表明，哈维氏弧菌极易破坏幼虾肠道微生态系统，而成虾对其具有一定的抵抗感染能力。WINTON等[25]将溶藻弧菌注射入凡纳滨对虾体内，在32～34℃时溶藻弧菌感染凡纳滨对虾的能力比在20～32 ℃更强。一旦养殖环境恶化或对虾免疫力下降将会引起细菌在体内的大量繁殖而导致对虾死亡。对虾感染病毒后可引发对虾肠道内菌群发生变化[4]，但二者的作用机制并不明确，需要进一步地研究。
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2. Key Laboratory for Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Science, Qingdao 266071, China