2015, Vol. 28
2. 河北大学 生命科学学院, 河北 保定 071002
近些年来，湖泊和池塘等淡水水域富营养化严重，蓝藻水华频繁发生，对生活于其中的水生生物造成了危害。有资料表明，在凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)养殖池塘中，铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)等蓝藻形成优势种与虾病暴发呈正相关，对虾发病池呈现硅藻到蓝藻优势的演替；而在生产中，养殖中后期的虾池，也经常暴发蓝藻水华，导致虾类原因不明的死亡[1, 2]。暴露于铜绿微囊藻中的克氏原螯虾(Procambarus clarkii)、凡纳滨对虾和罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)幼虾存活率显著降低，外观颜色及超微结构有明显变化[3, 4, 5]。目前普遍认为，铜绿微囊藻能产生多种微囊藻毒素(microcystin,MC)，其中最为常见的，含量最高毒性也最大的是MC-LR型毒素。这种毒素对多种水生动物和哺乳动物能产生毒害甚至致死作用[6, 7, 8]。然而，铜绿微囊藻是如何导致虾类死亡？对虾类的免疫系统又会产生怎样的危害？目前相关机理研究甚少。
同其他无脊椎动物一样，一般认为甲壳动物缺乏特异性免疫系统，而完全依赖非特异免疫系统来抵御病原体的侵染。对虾的免疫系统被分为细胞免疫和体液免疫。细胞免疫主要包括血细胞的吞噬作用、结节形成、包囊作用和凝集反应等；体液免疫反应主要依靠血淋巴中的一些酶类(如溶菌酶、酚氧化酶、超氧化物歧化酶等)、免疫因子(如抗菌肽、凝集素、溶血素等)以及调节因子如酚氧化酶原激活系统等[9]。
本文通过对凡纳滨对虾进行血窦注射微囊藻毒素MC-LR染毒，获取其肝胰腺及血细胞，采用Illumina Hiseq 2500测序获得了凡纳滨对虾在注射微囊藻毒素前后血细胞及肝胰腺的转录组信息，从微囊藻毒素对虾类肝胰腺和血细胞的细胞免疫毒性作用着手，探讨微囊藻毒素对虾类的毒性机理，以期为实现对虾健康养殖和疾病控制提供参考依据。
1 材料与方法 1.1 实验材料凡纳滨对虾购自上海市临港新城古棕路水产品批发市场。选择健康的、平均体重为15 g左右的对虾作为实验用虾。实验前在实验室内水循环养殖系统内暂养，使其适应室内养殖环境。
微囊藻毒素MC-LR购自宝柏(香港)贸易有限公司宝柏·中国，用PBS溶解。
1.2 实验方法 1.2.1 注射微囊藻毒素剂量的确定取平均体重为15 g的凡纳滨对虾分成4组，每组20尾，按虾的体重分别注射剂量为50 μg/kg、100 μg/kg和200 μg/kg(每千克虾注射MC-LR量)PBS溶解的MC-LR，对照组注射PBS(NaCl 8 g，Na2HPO4 2.9 g，KCl 0.2 g，KH2PO4 0.2 g；蒸馏水定容至1 000 mL)，注射量为0.01 mL/g [10]。注射后观察存活率变化，及时剔除死亡个体(以附肢不动判定为死亡标准)，记录6 h、12 h、24 h、48 h的对虾成活尾数。实验重复3次。实验过程中，水温控制在(26±1)℃，盐度为10。注射部位为第二腹节下血窦处。MC-LR用PBS溶解，加1‰的酚红做指示剂。以24 h死亡率为一半的MC-LR浓度作为最终注射浓度，最后确定100 μg/kg为MC-LR对凡纳滨对虾的注射剂量。
1.2.2 微囊藻毒素注射根据预实验的半致死剂量100 μg/kg注射对虾，实验条件同上，分为实验组(即注射MC-LR组)和对照组，各设3个重复。每个重复30尾虾，在24 h时从每个重复中各取6尾虾，最终实验组和对照组各得18尾，取肝胰腺和血淋巴，血淋巴经800 r/min离心收集血细胞，液氮保存备用。
1.2.3 RNA提取和检验总RNA抽提所用TRIzol为RNAiso Plus (TaKaRa)。由于血细胞不易研磨，在加入TRIzol后，使用漩涡振荡器MS1(IKA)2 500 r/min震荡3~5 min，至管中无明显沉淀物为止。其余操作过程按产品说明进行。抽提得到的总RNA使用1%琼脂糖凝胶电泳进行质量检验，剔除条带模糊的RNA样品。采用Illumina Truseq RNA sample prep Kit方法构建文库。
1.2.4 表达谱测序及分析采用Illumina Hiseq测序平台(上海美吉生物医药科技有限公司)完成凡纳滨对虾的表达谱测序，构建Illumina PE文库(200 bp)进行2×100 bp测序(EST)，和50 bp单端测序(表达谱)，对获得的测序数据进行质量控制，然后利用生物信息学手段对数据进行分析。
2 结果与分析 2.1 基因表达差异分析将获得的基因差异表达结果按照是否有显著性差异进行筛选，在有显著性差异的数据中再去除没有给出明确基因名称注释的序列。对结果进行分析后发现，注射MC-LR后血细胞中显著上调的基因有血小板反应蛋白(thrombospondin)和细胞周期素B(cyclin B)2种基因，肝胰腺样本中的酚氧化酶原(prophenoloxidase)、胰蛋白酶(trypsin)及C型凝集素(C-type lectin)等10种基因发生了显著上调(表1，表2)。
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表1 注射MC-LR后凡纳滨对虾血细胞中显著上调的基因 Tab. 1 The significantly up-regulated genes in hemocyte of microcystin injected shrimps |
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表2 注射MC-LR后凡纳滨对虾肝胰腺中显著上调的基因 Tab. 2 The significantly up-regulated genes in hepatopancreas of microcystin injected shrimp |
对两组样本中的差异基因进行Gene Ontology(GO)功能显著性富集分析，并初步筛选出与细胞免疫相关的GO功能注释(表3)。在血细胞样本组中GO显著性差异表达共有39个，包括细胞粘附(cell adhesion)、细胞杀伤(cell killing)及细胞粘附分子结合物(cell adhesion molecule binding)的表达等，证实了在凡纳滨对虾对抗MC-LR感染的免疫过程中细胞吞噬起到了重要作用。在肝胰腺样本组中GO显著性差异表达的共有40个，但并没有发现细胞免疫相关的GO显著差异性表达。然而有不少氧化还原酶及蛋白质代谢相关的GO显著性差异表达，说明在注射微囊藻毒素后凡纳滨对虾新陈代谢变得旺盛，而肝胰腺又是微囊藻毒素的靶器官和对虾解毒的主要器官，可能正是这样才能产生大量免疫调节相关的酶类来提高自身的免疫防御，并且通过代谢将有毒物质排出体外。
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表3 注射MC-LR后凡纳滨对虾血细胞中细胞免疫相关差异基因的GO分类 Tab. 3 Gene ontology of cellular immunity related differentially expressed genes in hemocyte of microcystin injected shrimp |
汇总了两组样本中基因表达差异的KEGG通路，并初步筛选出与细胞免疫相关的KEGG通路(表4，表5)。在血细胞和肝胰腺样本组中差异表达的KEGG 通路分别有130和174个。在染毒组血细胞和肝胰腺中都存在吞噬体(phagosome)、细胞凋亡(apoptosis)、内吞作用(endocytosis)和细胞粘附分子(cell adhesion molecules,CAMs)等与细胞免疫相关的通路，进一步证实了在凡纳滨对虾对抗MC-LR感染的免疫过程中细胞吞噬和细胞凋亡过程起到了重要作用。
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表4 注射MC-LR后凡纳滨对虾血细胞中细胞免疫相关显著性差异基因的KEGG通路 Tab. 4 KEGG pathway of cellular immunity related differentially expressed genes in hemocyte of microcystin injected shrimp |
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表5 凡纳滨对虾注射微囊藻毒素肝胰腺样本KEGG 通路差异表达结果中与细胞免疫相关部分 Tab. 5 Cellular immunity related KEGG pathways with significant difference in expression in hepatopancreas of microcystin injected shrimp |
对虾的体液免疫应答包括酶原(酚氧化)激活，凝血素合成和抗菌肽释放等，而细胞免疫反应则包括细胞凋亡，包埋，吞噬和结节形成等过程[11]。本实验发现微囊藻毒素侵染后，对虾酚氧化酶原激活系统和C型凝集素基因表达明显上调。酚氧化酶原激活系统中的各种因子以非活性状态存在于血细胞的颗粒中，极微量的微生物多糖就能激活该系统。它们可通过多种方式参与宿主防御反应，包括提供调理素(opsonin)，促进血细胞吞噬作用，形成结节或包囊以及介导凝集和凝固，产生杀菌物质，参与黑化反应，促使角质的硬化和伤口愈合等[12]。凝集素在对外来入侵异物进行的识别、防御、凝集、吞噬、包囊及其随后的创伤修复等一系列反应中协同其他各种免疫因子共同发挥作用，其主要作用可能是使血淋巴中的异物分子发生凝集，从而使这些病原体丧失进一步侵染机体和在组织中扩散的能力，以达到免疫防御的目的[13]。血淋巴中凝集素还具有重要的调理作用，可以将结合的异物分子传递给血细胞，由血细胞来完成最终的吞噬和杀灭作用，从而大大增强血细胞的吞噬作用[14]。而C型凝集素是较早被发现的一类凝集素，现有研究证明C型凝集素与对虾的血细胞吞噬活性的增强有极大的关系。在对虾对抗MC-LR的过程中，体液免疫和细胞免疫作用密切配合，酚氧化酶原激活系统和C型凝集素的显著性表达恰恰证明了细胞免疫吞噬作用和结节作用发挥着重要作用。
相比于体液免疫，目前在细胞免疫方面的工作相对还是有限的[15]。研究无脊椎动物细胞免疫机制有助于了解细胞信号的粘附和迁移。细胞反应主要涉及到吞噬作用，凋亡作用，成瘤作用，病原体的包埋作用。有研究表明在对虾对抗病毒感染的免疫反应过程中，吞噬作用和凋亡作用起到了比体液免疫更为重要的作用[16, 17]。
吞噬作用是一个依赖肌动蛋白的过程，是免疫系统的重要组成。免疫细胞首先识别外源微粒并与受体结合，在细胞膜上皮层细胞骨架重组后，颗粒被吞噬和内化，形成了吞噬体。动物的吞噬反应目的就是防御病原微生物入侵[18]。已经鉴定了一些涉及对虾吞噬作用调节的分子，包括Rab GTPases，Ran 蛋白，ADP核糖基化因子(ADP ribosylation facror)等。在本转录组中也筛选出了一些相关基因，虽然并无显著的差异性表达，但这可能跟这些基因的表达时间有关。而在血细胞GO富集性分析中发现细胞粘附(cell adhesion)显著性差异表达，以及在血细胞KEGG富集性分析中发现吞噬体(Phagosome)、内吞作用(Endocytosis)和细胞粘附分子(cell adhesion molecules ，CAMs)等通路差异表达，这些基因或通路都与细胞吞噬作用有着密切联系，说明吞噬作用在凡纳滨对虾对抗微囊藻毒素的免疫应答过程中起到了重要作用。
细胞凋亡是一种基因编程的细胞自杀过程，消除不必要的或病变的细胞，在胚胎发育，稳态，昆虫变态和免疫过程中扮演着重要的角色[19, 20]。半胱天冬蛋白酶(caspases)在细胞凋亡的各个阶段都起着重要的作用，是作为控制细胞凋亡启动和执行的主要蛋白[21]。已知Caspase-8是介导细胞凋亡通路所必需的受体，而caspase-3已被确认是caspase中起关键作用的基因[22]。有研究表明，微囊藻毒素能够诱导动物多种细胞发生细胞凋亡现象。刘秀霞等[23]研究了微囊藻毒素(MC-LR)对罗非鱼肝细胞的毒性作用，SCGE和流式细胞仪都能观察到明显的细胞凋亡现象，且与注射毒素时间和剂量存在一定关系。BE等[24]发现微囊藻毒素能够引起老鼠肝细胞的凋亡现象。张建英等[25]对鲫鱼的血淋巴进行1 nM的MC-LR处理，在2 h检测到明显的淋巴细胞的凋亡。WANG等[26]研究了日本囊对虾(M. japonicus)中一个新的细胞凋亡蛋白酶基因(Pj Caspase)，当对虾被病毒感染时Pj Caspase的mRNA表达显著上调。在本实验中KEGG显著性分析中有自然杀伤细胞调节细胞毒性(natural killer cell mediated cytotoxicity)，细胞凋亡(apoptosis)，细胞周期(cell cycle)等与细胞凋亡密切相关的通路显著性差异表达。说明细胞凋亡在凡纳滨对虾对抗微囊藻毒素过程中发挥了关键作用。
本文围绕注射MC-LR后凡纳滨对虾体内与细胞免疫相关基因的表达谱进行分析，结果表明染毒过程中，对虾细胞免疫特别是细胞吞噬及细胞粘附起到了重要作用。这为以后更加深入地研究无脊椎动物对抗毒素的先天性免疫分子机制提供了帮助。
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2. College of Life Science, Hebei University, Baoding 071002, Hebei, China