大熊猫Ailuropoda melanoleuca是我国特有的濒危物种之一。由于栖息地破坏、遗传物质流失、自身繁殖率低下等一系列问题，大熊猫的生存一直受到威胁(Shen et al., 2010；李静，2017；Kang & Li，2018)。近年来，大熊猫的生理、行为生态学和再生生物学取得了很大的进步，但由于研究材料受限，对大熊猫基因功能的研究相对较少，这也限制了对大熊猫基因调控网络的深入认识(Zhang et al., 2008；Shen et al., 2010；Wei et al., 2015；Kang et al., 2017)。

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一种具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞。由于这一特性，MSCs在再生医学和组织工程中备受关注(Wang et al., 2012)。Liu等(2013)已成功从大熊猫骨髓中分离出了MSCs，这为大熊猫细胞水平及细胞中不同生物进程的研究提供了原材料。但是关于大熊猫MSCs的细胞周期、生长、分化等生物进程的调控机制仍不清楚。

Krüppel样因子4(Krüppel-like factor 4，KLF4)是KLF家族中的一员(Schuh et al., 1986)，是一个重要的锌指转录因子。KLF4的C端含有3个C₂H₂锌指结构，通过这3个锌指结构与靶DNA或蛋白结合，并调节其转录(Ghaleb & Yang，2017；Yang et al., 2017)。已有研究表明，KLF4在细胞生长、分化和正常组织稳态维持等细胞过程中发挥重要作用(Zhang et al., 2013；Shatat et al., 2014；Mallipattu et al., 2016；Ghaleb & Yang，2017)。同时，KLF4在诱导多能干细胞中也发挥着重要的作用(Takashi et al., 2008)。Li等(2010)完成了大熊猫参考基因组的测序并公布了该基因组，但是，到目前为止，大熊猫Klf4基因的序列尚未得到实验验证。研究KLF4的特性和转录调控功能将有助于我们进一步了解大熊猫MSCs的增殖、分化及凋亡的分子机制。

为了进一步探究大熊猫Klf4基因的结构和功能，本文通过cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends，RACE)技术克隆获得了大熊猫Klf4基因的cDNA全长序列，并分析了其结构特征。此外，本文还通过病毒感染的方法实现在大熊猫MSCs中过表达KLF4，并通过RNA-seq方法进一步探索了KLF4在大熊猫MSCs中的功能。

1 材料与方法 1.1 实验材料

大熊猫MSCs以及睾丸、大脑、心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏组织由成都大熊猫繁育研究基地提供。实验所用Escherichia coli DH5α感受态细胞购自成都诺维赞生物科技有限公司，慢病毒载体pLKO.3G、psPAX2以及pMD2.G购自Addgene。

1.2 实验试剂

细胞培养基购于美国HyClone；胎牛血清、青霉素/链霉素混合物、细胞生长因子购于美国Invitrogen；β-actin抗体、FLAG抗体购于成都正能生物有限公司；二抗(山羊抗鼠抗体、山羊抗兔抗体)购于美国Proteintech。RNAiso Plus、反转录试剂盒PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser、SMART^TM RACE cDNA Amplification Kit购于日本TaKaRa；质粒小量提取试剂盒购于天根生化试剂(北京)有限公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购于成都擎科梓熙生物技术有限公司；ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit购于南京诺维赞生物科技有限公司。

1.3 实验方法 1.3.1 大熊猫MSCs的培养

大熊猫MSCs生长所需的低糖培养基包含10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素、10 ng·mL^-1表皮生长因子(Invitrogen)、5 ng·mL^-1碱性成纤维细胞生长因子和7.5 mmol·mL^-1谷氨酰胺-1(Invitrogen)。细胞在37 ℃，5%CO₂浓度的细胞培养箱中培养。

1.3.2 Klf4基因的克隆

从大熊猫MSCs中提取RNA并根据SMART^TM RACE cDNA Amplification Kit的说明书反转录获得3’RACE和5’RACE的cDNA模板，然后通过基因特异性引物3’outer-KF、3’inner-KF和5’outer-KF，5’inner-KF与RACE通用引物进行巢式PCR(引物序列见表 1)。PCR程序如下：94 ℃ 5 min；98 ℃ 30 s，70~60 ℃(每次循环递减0.5 ℃)，72 ℃ 1 min，20个循环；98 ℃ 30 s，57~65 ℃温度梯度30 s，72 ℃ 1 min，10个循环；72 ℃ 5 min。获得Klf4基因的3’末端和5’末端产物，经纯化后进行TA克隆并测序。

1.3.3 Klf4基因的序列分析

将Klf4基因的3’末端和5’末端产物拼接后通过NCBI BLAST在线程序进行核苷酸和氨基酸序列同源性分析；用SWISS-MODEL对KLF4的氨基酸序列特点进行分析，并通过I-TASSER预测其蛋白质三维结构(Zhang，2008；Ambrish et al., 2010；Yang et al., 2015)；通过MEGA 7.0构建系统进化树以分析大熊猫Klf4基因与其他物种的亲缘关系，基于KLF4的蛋白编码区(coding sequence，CDS)的核苷酸序列，采用邻接法，bootstrap重复1 000次计算各分支的置信度，各物种GenBank登录号为：人Homo sapiens(NM_001314052.1)、家鼠Mus musculus(NM_010637.3)、狗Canis lupus familiaris(XM_ 005626996.2)、黑猩猩Pan troglodytes(XM_01696 1392.2)、绿猴Chlorocebus sabaeus(XM_0079684 89.1)、牛Bos taurus(NM_001105385.1)、猕猴Macaca mulatta(NM_001142793.2)、野猪Sus scrofa(NM_001031782.2)、非洲爪蟾Xenopus tropicalis(NM_001017280.2)、家鸡Gallus gallus domesticus(XM_00 4949369.3)、兔Oryctolagus cuniculus(XM_017347 259.1)、猫Felis catus(NM_001173444.3)、褐家鼠Rattus norvegicus(NM_053713.1)、羊Ovis aries(NM_001164219.1)、北极熊Ursus maritimus(XM_008708 038.1)(Kumar et al., 2016)。

1.3.4 Klf4基因过表达载体的构建

以获得的3’RACE cDNA为模板，通过引物Full-length-Fw和Full-length-Rv经PCR扩增获得Klf4基因的CDS序列。以此为模板，再次通过PCR扩增的方法在KLF4 CDS的N端和C端分别加上1×FLAG标签和自剪切肽P2A序列。将获得的融合片段通过同源重组的方法克隆到酶切后的pLKO.3G载体中，组成慢病毒重组载体pLKO.Klf4。

1.3.5 KLF4重组慢病毒的产生及目的细胞的感染

在293T细胞密度达到80%~90%时，通过脂质体将10 μg目的质粒、7.5 μg psPAX2以及2.5 μg pMD2.G转染入293T细胞中。转染后48 h和72 h时，分别收集病毒上清。病毒经浓缩后感染大熊猫MSCs。每8 h感染一次，共感染3次。

1.3.6 实时荧光定量PCR(qPCR)和Western blot分析

取大熊猫睾丸、大脑、心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏组织，放入液氮中研磨，按照Trizol法提取总RNA，后用反转录试剂盒PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser分别将1 μg RNA反转录成cDNA。通过qPCR来检测目的基因及Klf4基因在大熊猫不同组织中的转录水平表达情况。qPCR(引物序列见表 2)的反应程序如下：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40个循环。采用2^-ΔΔCt的方法进行计算、分析结果。

在大熊猫MSCs中过表达了KLF4后，通过Western blot来检测KLF4的表达情况。收集感染pLKO.Klf4和pLKO.3G的细胞样品，经裂解液裂解变性后，用12%SDS-PAGE蛋白胶进行电泳，后经转膜、室温封闭后于4 ℃进行一抗过夜孵育。隔天，3次洗膜后，在室温下进行二抗孵育，1 h。洗膜后，通过蛋白质凝胶成像系统检测目的蛋白条带。

1.3.7 RNA-Seq

收集过表达KLF4的大熊猫MSCs和对照组pLKO.3G MSCs样品，由北京百迈克生物技术有限公司完成转录组测序分析工作。cDNA文库测序工作在Illumina Hiseq Xten平台上进行，使用FASTQC进行质量监控，获得了高质量的clean。通过Tophat2将这些clean与参考基因组序列比对，比对上的reads利用String Tie进行组装。然后使用EBseq进行差异分析，将满足筛选条件(错误发现率 < 0.01和差异倍数>2)的差异表达基因进行KEGG富集分析。

2 结果 2.1 Klf4基因的克隆与序列分析

大熊猫Klf4基因cDNA的全长为2 431 bp，其中，5’UTR长60 bp，3’UTR长934 bp，CDS长1 437 bp，编码479个氨基酸，分子质量约为51.9 kDa(GenBank登录号：MK075241)。Klf4基因的poly A尾上游18 bp处有1个多聚腺苷酸化信号(AATAAA)(图 1：A)。KLF4蛋白的N端没有发现信号肽，C端则包含3个保守的C₂H₂锌指结构，分别位于氨基酸395~424、425~454、455~478处。此外，KLF4中还存在1个富含丝氨酸的结构域(图 1：B)。KLF4的三级结构包含3个α-螺旋，每个α-螺旋中分布着1个锌指结构(图 1：C)。系统发育树表明大熊猫Klf4基因与北极熊Ursus maritimus的亲缘关系最近(图 2)。

2.2 Klf4基因在大熊猫不同组织中的表达分析

为探索KLF4在大熊猫不同组织中的功能，通过qPCR的方法检测Klf4基因在大熊猫不同组织中的表达分布。结果发现，Klf4基因在睾丸中的表达量最高，其次是肺、脾脏、肾脏，而大脑、肝脏和心脏中的表达量相对较低(图 3)。

2.3 KLF4对大熊猫MSCs的调控

为了进一步了解KLF4在大熊猫骨髓MSCs中的作用，通过慢病毒感染的方法过表达了KLF4(图 4：A)，并在转录组水平上分析其调控作用。转录组分析发现KLF4过表达后，大熊猫MSCs出现了179个差异表达基因，包括79个上调基因和100个下调基因(图 4：B)，这些差异表达基因的层次聚类分析结果见图 4：C。对这些差异基因进行KEGG富集分析发现，差异性表达基因显著富集在军团杆菌病、Hippo信号通路、RNA转运、TNF信号通路以及咖啡因代谢等通路(图 4：D)。

2.4 RNA-Seq结果的验证

为了验证转录组数据的可靠性，通过qPCR分别对上调基因MYL6B、TMC8、TMEM200B、SLAIN1、SOCS3以及下调基因CASP10、P2RY10的表达情况进行了验证(图 5：A)。同时，还有一些与细胞周期调控相关基因(Cyclin D1和P21)，以及与Klf4基因相互作用的Nestin、Pax6基因的表达情况(图 5：B)。qPCR结果与转录组数据的结果保持一致，说明转录组数据可真实反映基因表达量的差异情况。

3 讨论

本研究从大熊猫MSCs中克隆获得了大熊猫Klf4基因cDNA全长，共2 431 bp，编码479个氨基酸。大熊猫KLF4的N端比人、鼠的少9个氨基酸残基，而C端具有KLF家族高度保守的C₂H₂结构，该结构介导KLF4与靶DNA或蛋白的结合。Klf4基因在大熊猫睾丸中的表达量最高，表明Klf4基因可能参与调控其中重要的生理过程，如精子的发生过程(Yang et al., 2017)；此外，Klf4基因在脾脏、肾脏中的表达也较高，表明Klf4基因在脾脏、肾脏中可能同样也发挥着重要的调控作用，如KLF4会影响肾足状突细胞的表型和功能(Kaori et al., 2014)。KLF4在大熊猫不同组织中的分布差异可能是机体内稳态调控的结果。

基于转录组测序结果分析，在大熊猫MSCs中过表达KLF4后，差异表达基因最显著富集在军团杆菌病代谢通路。KLF4可能通过影响大熊猫MSCs中真核翻译延伸因子1α(eEF1A)的表达进而影响军团杆菌病代谢。eEF1A是一个多功能蛋白，在蛋白质的翻译延伸、细胞凋亡、细胞信号转导以及心血管疾病发生等过程中发挥重要作用(Khacho et al., 2008)。KLF4调控eEF1A1和eEF1A3的表达发生改变，进而引起军团杆菌病代谢的改变。

KLF4可显著影响大熊猫MSCs中的RNA转运过程。转录组结果表明，KLF4可显著下调输出蛋白XPOT的表达。XPOT参与成熟tRNA从细胞核到细胞质的转运过程(Gupta et al., 2016)。XPOT的表达量减少，因此与它的锚定蛋白RanGTP的结合减少，导致tRNA转运过程中的能量供应不足，进而影响细胞核与细胞质中RNA的运输。

此外，在KLF4过表达后，肿瘤抑制基因LATS1的表达量减少。LATS1是Hippo信号通路的重要组成成分，已有研究表明，低表达的LATS1会抑制Hippo信号通路，进而影响小鼠MSCs的增殖、迁移和分化过程(Qiu et al., 2015)。类似的，在大熊猫MSCs中，KLF4可能通过下调LATS1的表达，抑制Hippo信号通路。

与之前的报道不同(Wassmann et al., 2007；Chen et al., 2011)，在大熊猫MSCs中，KLF4可通过上调细胞周期蛋白cyclin D1同时下调细胞周期激酶抑制基因P21的表达来促进细胞增殖。同时，KLF4可能通过影响细胞凋亡相关基因CASP10和TMC8的表达而参与调控大熊猫MSCs的凋亡过程。

本研究结果进一步揭示KLF4在大熊猫MSCs中发挥着重要的调控作用，后续可深入研究其具体的调控机制。本文扩展了大熊猫分子水平的相关研究，为今后的相关研究提供了理论依据，为大熊猫遗传资源的保护和利用提供了更多的思路。