高原鼠兔Ochotona curzoniae隶属兔形目Lagomorpha鼠兔科Ochotonidae鼠兔属Ochotona(蒋志刚等，2015)，是青藏高原特有的小型哺乳类世居动物，主要栖息在海拔3 000~5 000 m的高寒草甸及高寒荒漠草原地带(施银柱，樊乃昌，1980；丁晓涛等，1999)，其生境的含氧量为139~203 g·m^-3；高原鼠兔能有效地从低氧环境中摄取氧、转运氧和利用氧(饶鑫峰，2010)，对高原低氧环境具有很强的适应性(Kilic et al., 2004；齐新章等，2008；王晓君等，2008；Zhu et al., 2009；Gonzales，2013)。

先前研究表明，精子特异性乳酸脱氢酶(Ldh-c)基因只在鸟类和哺乳类的精子中特异性表达(Goldberg，1975)，而在体细胞中不表达(Wheat & Goldberg，1977；Goldberg，1985)。而我们的研究发现，精子特异性乳酸脱氢酶(sperm-specific lactate dehydrogenase，LDH-C₄)不仅在高原鼠兔睾丸和精子中表达，在心肌、肝脏和脑等组织中也有表达(Wang et al., 2013)。LDH-C₄是乳酸脱氢酶的一种同工酶(Gupta，2012)，主要催化丙酮酸和乳酸(lactic acid，LD)相互转化(Smithies，1959；Everse & Kaplan，1973)。酶促动力学研究结果表明，LDH-C₄对丙酮酸的亲和力高于对LD的亲和力，其酶促反应不易受高浓度LD的抑制(Hereng et al., 2011)，有利于催化丙酮酸转化为LD，说明LDH-C₄有利于无氧糖酵解。应用LDH-C₄特异性抑制剂(N-isopropyl oxamate)能显著降低高原鼠兔骨骼肌中LDH比活力、减少LD和ATP的生成，并显著降低高原鼠兔的运动能力。为了进一步深入探讨Ldh-c基因在高原鼠兔心肌、肝脏和脑组织中的作用及机理，本文通过构建特异性沉默Ldh-c基因载体，用腺病毒包装，通过腹腔注射7 d后，检测3种组织中Ldh-c基因在mRNA和蛋白水平的表达，测定组织中LDH比活力、LD和ATP的含量，进一步探讨高原鼠兔适应低氧的生理机制。

高原鼠兔捕捉于青海省海南州贵德县拉脊山(101°28′E，36°72′N，海拔3 900 m)。采样点氧分压为62 kPa，含氧量为182 g·m^-3。样本量27只，体质量150~200 g，随机分为3组，每组9只。第1组为干扰组(RNAi-LDHC)，向高原鼠兔腹腔注射腺病毒pMultiRNAi-Ldhc，注射剂量为0.650 mL；第2组为空壳组(RNAi-HK)，向腹腔注射等剂量腺病毒pMultiRNAi-NS；第3组为空白对照组(Control)，不注射。高原鼠兔分组注射后饲养7 d，实验前静息30 min，5%戊巴比妥钠麻醉后，用EDTA₂K₂抗凝管从颈部采血2~3 mL，离心10 min(4 000 r·min^-1)，分离血浆，4 ℃保存；采集心肌、肝脏和脑组织样品立即保存于液氮。采样过程所涉及处理动物的措施均按照国家《实验动物管理条例(GB14923-2010)》执行。

根据GenBank报道的高原鼠兔Ldh-c基因的cDNA序列(HQ704678)，选择2个靶位点(321-339，855-875)，用Blast进行序列同源性分析，并用RNAstructure 4.2对其二级结构预测。siRNA干扰序列为LDHC321：TTAGTACTTCAAAGATTAC，LDHC855：GCTATTGGACTGTCTGTGA。

根据高原鼠兔和人Ldh-c基因的编码区序列，设计并合成shRNA靶序列，用合成的单链shRNA寡核苷酸退火后得到双链产物，用低熔点的琼脂糖凝胶电泳回收，并验证所回收的DNA片段，构建Ldh-c基因特异性shRNA表达载体，转入感受态细胞，挑取阳性克隆在培养基中培养过夜，提取质粒，测序鉴定插入序列。根据DNA测序结果，将与所设计shRNA序列100%相同的重组质粒及空质粒分别进行腺病毒包装。

序列的合成及测序、质粒的链接与病毒包装由武汉晶赛生物有限公司完成。

TRIzol(Invitrogen Life Technologies)法提取心肌、肝脏和脑组织总RNA，核酸蛋白含量检测仪测定A₂₆₀/A₂₈₀值(1.8＜A₂₆₀/A₂₈₀＜2.0)及浓度(≥0.4 μg·μL^-1)，取4 μg总RNA采用First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Scientific，USA)试剂盒制备cDNA。根据高原鼠兔Ldh-a、Ldh-b和Ldh-c基因的cDNA序列，以Ldh-a、Ldh-b和Ldh-c基因同源性低的cDNA序列为模板设计特异性引物用于荧光定量PCR。引物序列如下所示(表 1)，按照SYBR^©Premix Ex Taq Ⅱ (Tli RNAaseH Plus)(TaKaRa)试剂盒说明配制反应体系：10 μL SYBR^@Premix Ex Taq Ⅱ，0.8 μL PCR Forward Primer，0.8 μL PCR Reverse Primer，0.4 μL Rox Reference Dye Ⅱ，2 μL cDNA，加水至总体积20 μL。反应条件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s；60 ℃ 34 s，40个循环；ABI 7500采集和分析数据。各样品目的基因和管家基因的浓度于机器直接生成。每个样品的目的基因浓度除以其管家基因浓度，即为该样品该基因校正后的相对含量。

用总蛋白提取试剂盒提取心肌、肝脏和脑组织总蛋白，采用Piercetm BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific，USA)测定浓度。取40 μg蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，转到0.22 PVDF膜上。用5%脱脂奶粉稀释液常温封闭2 h；与一抗(抗LDH-C：abcam公司兔单克隆抗体，1: 10 000稀释；抗GAPDH：abcam公司单克隆抗体，1: 4 000稀释)4 ℃孵育过夜；TBST洗涤后，用羊抗兔IgG (山羊抗兔，abcam公司，1: 2 000稀释)常温孵育2 h后再用TBST洗涤。采用ECL荧光试剂盒(Thermo Fisher Scientific，USA)曝光、凝胶成像系统(Bio-Rad，USA)拍照。以LDH-C蛋白条带的灰度值与内参GAPDH的灰度值的比值表示该样品的相对蛋白表达水平。

LD含量及LDH比活力测定：心肌、肝脏和脑组织用0.9%生理盐水冰浴匀浆，质量/体积为1: 9，4 ℃ 5 000 r·min^-1离心10 min，取上清液。采用比色法检测组织LD含量及LDH比活力，按照试剂盒(南京建成生物技术有限公司，中国)说明操作(许利娜等，2015)。

ATP含量测定：采用萤光素-萤光素酶法检测组织中ATP含量，按照ATP试剂盒(江苏碧云天生物技术有限公司，中国)说明操作。组织用试剂盒中裂解液冰浴匀浆(质量/体积为1: 5)后，4 ℃ 12 000 r·min^-1离心10 min，取上清。以ATP浓度与裂解液蛋白浓度的比值来表示组织中ATP的相对含量(单位：nmol·mg^-1)，参考许利娜等(2015)。

取高原鼠兔血清，生理盐水稀释后，采用LD含量和LDH比活力测试盒(南京建成生物工程有限公司)测定。

腺病毒pMultiRNAi-Ldhc对各指标的干扰效率按照以下公式计算：干扰组干扰效率=(空白对照组平均值-干扰组平均值)/空白对照组平均值，空壳组干扰效率=(空白对照组平均值-空壳组平均值)/空白对照组平均值。

使用Excel 2007和SPSS整理数据并分析，采用Kolmogoroe-Simirnov和Levene检验数据的正态性和方差同质性。符合正态分布并具有同质性的数据采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)。数据用Mean±SD表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

荧光定量PCR结果表明，高原鼠兔心肌组织中Ldh-a、Ldh-b和Ldh-c基因在mRNA水平均有表达，注射腺病毒7 d后，Ldh-a和Ldh-b基因表达在干扰组、空壳组和空白对照组之间差异无统计学意义(P＞0.05)，但能特异性地沉默高原鼠兔Ldh-c基因表达；与空白对照组相比，干扰组中Ldh-c基因表达水平极显著降低(P＜0.01)，干扰效率为48.11%。干扰组、空壳组和空白对照组中LDH-A和LDH-B亚基均表达，且差异无统计学意义(P＞0.05)；与空白对照组相比，干扰组LDH-C亚基表达极显著减少(P＜0.01)，干扰效率为19.27%。同时LDH比活力、LD和ATP的含量也显著降低，与空白对照组相比，干扰组LDH比活力极显著减少(P＜0.01)，干扰效率为25.58%；干扰组LD含量极显著减少(P＜0.01)，干扰效率为41.94%；干扰组ATP含量极显著减少(P＜0.01)，干扰效率为21.23%(图 1)。

图 1 Ldh-c基因在高原鼠兔心肌组织的表达(n=9) Fig. 1 The expression of Ldh-c gene in the heart of Ochotona curzoniae (n=9) A. Ldh-a基因mRNA的表达水平，B. Ldh-b基因mRNA的表达水平，C. Ldh-c基因mRNA的表达水平，D.腺病毒pMultiRNAi-Ldhc对Ldh-c基因的干扰效率，E. LDH-C蛋白的表达水平，F.腺病毒pMultiRNAi-Ldhc对LDH-C蛋白的干扰效率，G.腺病毒pMultiRNAi-Ldhc对乳酸脱氢酶(LDH)比活力的影响，H.腺病毒pMultiRNAi-Ldhc对LDH的干扰效率，I.腺病毒pMultiRNAi-Ldhc对乳酸(LD)含量的影响，J.腺病毒pMultiRNAi-Ldhc对LD的干扰效率，K.腺病毒pMultiRNAi-Ldhc对ATP含量的影响，L.腺病毒pMultiRNAi-Ldhc对ATP的干扰效率；其中A、B、C和E图上侧电泳图和免疫印迹图分别表示Ldh-a、Ldh-b和Ldh-c基因mRNA以及LDH-C蛋白的表达模式；1、2和3分别表示干扰组、空壳组和空白组；*P＜0.05，**P＜0.01；图 2、图 3同。 A. expression level of Ldh-a mRNA, B. expression level of Ldh-b mRNA, C. expression level of Ldh-c mRNA, D. interference efficiency of pMultiRNAi-Ldhc on Ldh-c gene, E. expression level of LDH-C protein, F. interference efficiency of pMultiRNAi-Ldhc on LDH-C protein, G. effect of pMultiRNAi-Ldhc on the activity of lactate dehydrogenase (LDH), H. interference level of LDH, I. effect of pMultiRNAi-Ldhc on the content of lactic acid (LD), J. interference level of LD, K. effect of pMultiRNAi-Ldhc on the content of ATP, L. interference level of ATP; in figs. A, B, C and E, the electrophoresis and Western Blot results represent the expression pattern of Ldh-a, Ldh-b, Ldh-c mRNA and LDH-C protein, respectively; 1, 2 and 3 represent RNAi-LDHC, RNAi-HK and control, respectively; *P < 0.05, **P < 0.01; the same as fig. 2 and fig. 3.

图选项

荧光定量PCR结果表明，高原鼠兔肝脏组织中Ldh-a、Ldh-b和Ldh-c基因在mRNA水平均有表达，注射腺病毒7 d后，Ldh-a和Ldh-b基因表达在干扰组、空壳组和空白对照组之间差异无统计学意义(P＞0.05)，但能特异性地沉默高原鼠兔Ldh-c基因表达；与空白对照组相比，干扰组中Ldh-c基因表达水平的差异有高度统计学意义(P＜0.01)，干扰效率为70.16%。干扰组、空壳组和空白对照组中LDH-A和LDH-B亚基均有表达，且差异无统计学意义(P＞0.05)；与空白对照组相比，干扰组LDH-C亚基极显著减少(P＜0.01)，干扰效率为25.82%。同时LDH比活力、LD和ATP的含量也显著降低，与空白对照组相比，干扰组LDH比活力极显著减少(P＜0.01)，干扰效率为28.16%；干扰组LD含量显著减少(P＜0.05)，干扰效率为15.90%；干扰组ATP含量极显著减少(P＜0.01)，干扰效率为24.66%(图 2)。

图 2 Ldh-c基因在高原鼠兔肝脏组织的表达(n=9) Fig. 2 The expression of Ldh-c gene in the liver of Ochotona curzoniae (n=9)

图选项

荧光定量PCR结果表明，高原鼠兔脑组织中Ldh-a、Ldh-b和Ldh-c基因在mRNA水平均有表达。注射腺病毒7 d后，Ldh-a和Ldh-b基因表达在干扰组、空壳组和空白对照组之间差异无统计学意义(P＞0.05)，但能特异性地沉默高原鼠兔Ldh-c基因表达；与空白对照组相比，干扰组中Ldh-c基因表达水平极显著降低(P＜0.01)，干扰效率为49.08%。干扰组、空壳组和空白对照组中LDH-A和LDH-B亚基均有表达，且差异无统计学意义(P＞0.05)；与空白对照组相比，干扰组LDH-C亚基极显著减少(P＜0.01)，干扰效率为25.36%。同时LDH比活力、LD和ATP的含量也显著降低，与空白对照组相比，干扰组LDH比活力显著减少(P＜0.05)，干扰效率为16.65%；干扰组LD含量显著减少(P＜0.05)，干扰效率为12.78；干扰组ATP含量极显著减少(P＜0.01)，干扰效率为18.50%(图 3)。

图 3 Ldh-c基因在高原鼠兔脑组织的表达(n=9) Fig. 3 The expression of Ldh-c gene in the brain of Ochotona curzoniae (n=9)

图选项

结果表明，血清中LDH比活力和LD含量，空壳组和空白对照组之间差异无统计学意义(P＞0.05)；与空白对照组相比，干扰组的LDH比活力和LD含量显著减少(P＜0.05)，干扰效率分别为18.43%和18.90%(图 4)。

图 4 腺病毒pMultiRNAi-Ldhc对高原鼠兔血清中乳酸脱氢酶比活力和乳酸含量的影响(n=9) Fig. 4 Effects of pMultiRNAi-Ldhc on the activity of lactate dehydrogenase (LDH) and the content of lactic acid (LD) in the serum of Ochotona curzoniae (n=9) A.腺病毒pMultiRNAi-Ldhc对高原鼠兔血清中LDH比活力的影响，B.腺病毒pMultiRNAi-Ldhc对高原鼠兔血清中LD含量的影响，C.腺病毒pMultiRNAi-Ldhc对高原鼠兔血清中LDH和LD的干扰效率；*P＜0.05。 A. effect of pMultiRNAi-Ldhc on the activity of LDH in plateau pika serum, B. effect of pMultiRNAi-Ldhc on the content of lactic acid in plateau pika serum, C. interference level of LDH and lactic acid in plateau pika serum; *P < 0.05.

图选项

RNA干扰是近年来发现的普遍存在于生物体内的一种古老的现象，在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达(姜怀春，李宏，2004)。在研究基因功能上RNA干扰有以下优点，一是简单易行；二是周期短，成本低；三是沉默效率高，具有高度特异性(何正波等，2009)。本文通过构建特异性腺病毒结果表明，用RNA干扰技术干扰Ldh-c基因效果好。

腹腔注射法操作比较简单，注射时针头不宜刺入腹腔太深，太深则会刺入内脏，太浅不易穿过腹腔壁，最佳深度为3~5 cm，就可以很好进药(俞玉忠，穆斌，2011；祝春青等，2012；姜国良等，2013)，其可行性强，能精准控制给药量(祝春青等，2012)，且腹腔面积广并分布大量血管和淋巴管，具有很强的吸收能力(姜国良等，2013)。因此，腹腔注射的腺病毒能充分进入组织并有效地干扰Ldh-c基因。本研究构建了Ldh-c基因特异性载体包装的腺病毒，向高原鼠兔注射后饲养7 d，结果表明，腺病毒能够干扰Ldh-c基因的表达。本文结果显示，运用RNA干扰技术腹腔注射腺病毒pMultiRNAi-Ldhc后，在mRNA水平和蛋白水平均能降低组织中Ldh-c基因的表达，同时降低LDH比活力、LD和ATP含量以及血清中LDH比活力和LD含量，说明腹腔注射的腺病毒在心肌、肝脏和脑组织中发挥了作用，沉默了Ldh-c基因的表达，腺病毒pMultiRNAi-Ldhc对高原鼠兔心肌、肝脏和脑组织中LDH比活力、LD和ATP含量的干扰效率分别为25.58%、41.94%和21.23%；28.16%、15.90%和24.66%以及16.65%、12.78%和18.50%。Wong等(1997)表明N-isopropyl oxamate对LDH-C₄具有较强的抑制作用，而对LDH-A₄和LDH-B₄的抑制作用较小，先前研究向高原鼠兔股二头肌注射N-isopropyl oxamate，研究心肌、肝脏和脑组织中LDH-C₄的作用机理，结果表明，当高原鼠兔血液中N-isopropyl oxamate浓度为0.08 mmol·L^-1时，其心肌、肝脏和脑组织中LDH比活力、LD和ATP含量显著下降，N-isopropyl oxamate对高原鼠兔心肌、肝脏和脑组织中LDH比活力、LD和ATP含量的抑制率分别为31.98%、20.90%和28.70%；30.19%、32.22%和24.94%；30.78%、46.47%和21.04%(李筱等，2015；许利娜等，2015；魏琳娜等，2015)；前期研究表明用N-isopropyl oxamate注射骨骼肌后，高原鼠兔骨骼肌的LDH比活力、LD和ATP含量相应减少，其运动能力也显著降低(Wang et al., 2015)，均与本文结果相近。这是由于LDH-C₄沉默了C基因的表达从而减少了LDH-C₄的合成，降低了无氧糖酵解水平。这些结果表明，LDH-C₄通过催化无氧糖酵解过程，为高原鼠兔组织提供生命活动的部分ATP。

总之，Ldh-c基因在高原鼠兔组织中的表达是对高原低氧环境的适应机制。LDH-C₄通过催化糖酵解过程降低高原鼠兔心肌、肝脏和脑组织中对有氧代谢氧的依赖性，为其生命活动提供部分ATP，以保证缺氧条件下高原鼠兔机体的供能，使其减小了在低氧环境中对氧的依赖，增强了高原鼠兔对低氧环境的适应。